免疫组化与原位杂交.ppt

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1、免疫组织化学的主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。抗体抗体(Antibody)：1、多克隆抗体：、多克隆抗体：2、单克隆抗体：、单克隆抗体：抗原与抗体的关系：没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗原物质，也无法检测抗体的存在，利用抗体可以检测抗原物质。1、细胞标本的取材：l穿刺吸取涂片法该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。l体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必

2、须及时处理，更不宜加固定液。l 培养细胞标本的取材培养细胞标本的取材:可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，只需将载玻片或盖玻片插细胞有贴壁生长的特性，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。法处理。2、组织标本的取材：组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡 2h以上的组织，可能有不同

3、程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。固定：固定：固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。用于免疫组织化学的固定剂种类较多，用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要重视固定剂的选择。重视固定剂的选择。常用醛类固定剂。2、注意事项：v应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。v组织块不宜过大过厚,必须小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织

4、块厚度必须控制在0.3cm以内。v固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。v组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。3、固定方法：、固定方法：v浸入法浸入法(Immersion method)：将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温(4)环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在212h之间。v灌注法灌注法(Irrigation method)：此法适用于动物实验研究。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织，达到充分固定之目的。灌注中洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。四、组织切片四、组织切片应用于光镜的免

5、疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在 20100m，有利于追踪神经纤维的走行。冰冻切片冰冻切片:是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。石蜡切片石蜡切片:其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。抗原修复抗原修复是指通过加热或酶消化的是指通过加热或酶消化的方法使经醛类固定剂处理的组织的免疫方法

6、使经醛类固定剂处理的组织的免疫组化染色效果增进。组化染色效果增进。n胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：可打开醛键，解除交联，可打开醛键，解除交联，暴露抗原暴露抗原n高压加热法：高压加热法：保持高压保持高压5 5分钟，后使液体分钟，后使液体缓慢恢复至室温。可暴露抗原缓慢恢复至室温。可暴露抗原n微波加热法：微波加热法：1010分钟或分钟或5 5分钟分钟2 2次。可解除次。可解除交联。交联。1、石蜡切片脱蜡到水：、石蜡切片脱蜡到水：2、预处理：、预处理：需要时可选用需要时可选用3%过氧化氢溶液阻过氧化氢溶液阻断过氧化物酶。断过氧化物酶。3、抗原修复处理：、抗原修复处理：根据需要选用根据需要选用 4、染

7、色：、染色：PBS液洗涤：5分钟2次；l 正常山羊血清封闭：室温或3720分钟；l 滴加一抗：37 1-2小时或4 过夜；l PBS液洗涤：5分钟2次；l 滴加二抗：室温或37 30分钟；l PBS液洗涤：5分钟2次；l SABC：室温或37 30分钟；l PBS液洗涤：5分钟4次。5、检测：、检测：即显色反应 酶作用底物：DAB辣根过氧化物酶 NBT/BCIP碱性磷酸酶6、复染：、复染：苏木素、核红、1-2%甲基绿7、脱水、透明、封片：、脱水、透明、封片：抗体的保存和配制：抗体的保存和配制：1、抗体的保存：、抗体的保存：放入-20-40冰箱中保存备用,一般可保存12年。小量分装的抗体可1次用

8、完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在 4可存放13天，超过7天效价显著降低。有l 抗体稀释的配制：抗体稀释的配制：常用常用0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲液作抗体稀释液。缓冲液作抗体稀释液。l 抗体的最佳稀释度：抗体的最佳稀释度：由于各种抗体的效价不由于各种抗体的效价不 同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况 作适当的调整。常为作适当的调整。常为1：100或或1：200。正确设计对照方法：正确设计对照方法：其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照。常用的对

9、照方法包括：阳性对照；阴性对照；阻断试验；替代对照；空白对照；自身对照；吸收试验。1、阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。2、阴性对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。酶作用底物：DAB辣根过氧化物酶 NBT/BCIP碱性磷酸酶1 1、必须设对照：、必须设对照：设阴性对照和阳性对照设阴性对照和阳性对照2 2、抗原表达

10、必须在特定部位：、抗原表达必须在特定部位：分胞浆、胞核及胞膜表达分胞浆、胞核及胞膜表达3 3、阴性结果不能视为抗原不表达：、阴性结果不能视为抗原不表达：4、阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：由于细胞内含抗原量不同，由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性染色定位于细胞，阳性染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分且与阴性细胞相互交杂分布；布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱折区域，切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强

11、度，区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。不能用于判断阳性。5、阳性结果的定量判断：常规办法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、+、+等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另一种先进的免疫细胞化学计量分类技术流式细胞光度计技术。原位杂交组织化学技术是将核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项新技术，先用标记的已知核酸序列片段作为探针，与组织、细胞内待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，再通过组织化学或免疫组化方法在细胞原位呈色显示杂交信号。l按碱基配对原则，两条核苷酸单链(DNA

12、，DNA或DNA，RNA)中，一条碱基序列与另一条碱基互补配对，在一定条件下可形成双链复合体。l原位分子杂交技术利用已知核苷酸序列DNA片段作为探针，按碱基配对互补原则识别并特异性结合待测DNA或RNA(组织切片或细胞涂片)。1、试剂的配制：、试剂的配制：如如DEPC水的配制 原位杂交所有液体试剂都应经DEPC水处理。灭活蛋白质，抑制RNA酶。方法：取DEPC 1ml加入1000ml蒸馏水中，经猛烈振摇后，室温静置数小时，然后高压灭菌。n载玻片先用洗洁精浸泡过夜或酸泡；n用自来水冲洗，双蒸水洗2-3次；n置180干烤2h，或经15磅高压灭菌20min。nLysine涂片，干燥后使用。或2 AP

13、ES浸片，晾干，180干烤，备用。n新盖玻片分散开，在通风条件下于0.1mol/L HCl中煮20min，冷却后，倒掉盐酸；n用去离子水漂洗后，竖放在架子上自然干燥；n硅化盖玻片（在通风条件下），将单块盖玻片在DMDC(二甲二氯硅烷)液中浸泡数分钟，然后竖放在架子上干燥；n收集干燥盖玻片放于培养皿中，用去离子水漂洗数次；n用铝箔将放盖玻片的培养皿包好，于180干烤4h，取出冷至室温后，进行后续处理。nDNA比较稳定，mRNA容易降解，在取材时组织标本应尽可能新鲜。外科手术标本，取材后立即置于冰上，尽量减少RNA降解。一般新鲜组织和培养细胞应30min内固定。n避免外源性RNA酶引起靶组织RNA

14、丧失，取材时戴一次性手套。n所用物品经DEPC水处理高压灭菌，所用溶液用DEPC水配制。n避免核酸降解n保存组织形态结构n增加组织通透性l冰冻切片冰冻切片 手术室取材，标本用OCT（甲基纤维素）包埋，液氮速冻，恒冷切片机切片(6-8m)；4多聚甲醛固定2Omin，放置37，PBS洗后逐级酒精脱水，低温-20至-70保存。n新鲜细胞4多聚甲醛4固定10min，自然干燥；n标本置-8O保存。细胞涂片的制备细胞涂片的制备n冰醋酸:乙醇(3:1)4固定20min，离心弃上清液；n用新鲜固定液调整细胞浓度；n将细胞滴在湿载片上，略干；n乙醇脱水330min；n正丁醇室温下处理，空气中干燥，准备杂交。1

15、1、脱蜡：、脱蜡：石蜡切片常规脱蜡 二甲苯梯度酒精水30min-2h4、杂交：n将探针DNA和杂交液混合后，煮沸变性10min，迅速置冰上冷却；n每张切片滴加10-20l变性杂交液，盖上硅化盖玻片；n将切片放入2SSC湿盒内，38-42温箱孵育24-36h杂交。确保原位杂交实验操作和结果的准确性、特异性、敏感性和重复性。阳性对照阴性对照 常规办法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、+、+等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量。(1)探针标记的质量：同位素探针的比放射性（cpm/g）强度（如浓度达0.5ng/l，3-H标记核酸探针为10 8 cpm/l；35-S，32-P为51

16、0 8110 9 cpm/l）；非同位素探针 10 10 pg ，达到2 2 ng l。(2)探针保存的时间：DNA探针保存可达1年，要注意同位素探针的半率期；RNA探针不稳定，应在-20以下保存，可达6个月。及时及时充分固定。活组织离体30分钟内固定；固定时间要充分；组织块固定12小时,不超过2周。l切片放入冰箱中保存。n消化酶的浓度：过低：待测核酸暴露不充分，从而降低杂交信号或没有杂交信号。过高：组织结构受到严重损害，核酸游离，切片易碎或脱片。n蛋白酶失活。n核酸酶（如RNase）污染。n杂交温度：过高或过低，探针和待测核酸的杂交体都不易形成。n杂交环境：漂浮切片法杂交环境相对稳定；贴片法杂交环境不稳定（如湿盒蒸汽对探针的稀释等）。