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1、基基 因因 治治 疗疗Gene therapy基因治疗的概念和发展基因治疗的概念和发展基因治疗的载体基因治疗的载体重要疾病的基因治疗重要疾病的基因治疗基因治疗（gene therapy），就是指向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。（李立家等，2004）广义地说，基因治疗就是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。狭义的说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。（杜宝恒，2000）第一节 基因治疗的概念及其策略一、基因治疗（一、基因治疗（Gene therapy）概念）概念1、发病

2、机制在DNA水平上已经清楚；2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的前提条件二、基因治疗的前提条件（1）基因置换（）基因置换（gene replacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；完全恢复正常状态；（2）基因修复（）基因修复（gene correction）将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留；将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留；（3）基因修饰）基因修饰/基因增补（基因增补（gene aug

3、mentation）将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强；功能或使原有的某些功能得以加强；（4）基因失活（）基因失活（gene inactivation）利用反义利用反义RNA、核酶或肽核酸等反义技术及、核酶或肽核酸等反义技术及RNA干涉（干涉（RNAi）等能特异地封闭）等能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的；基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的；（5）免疫调节（）免疫调节（immune adjustm

4、ent）将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，从而达到预将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。防和治疗疾病的目的。第一节 基因治疗的概念及其策略三、基因治疗的总体策略三、基因治疗的总体策略第一节 基因治疗的概念及其策略四、基因治疗的途径四、基因治疗的途径1.ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。内，让外源基因表达以改善患者症状。2.i

5、n vivo法，直接将外源法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。内表达发挥治疗作用。in vivo法比法比ex vivo法更简单、直法更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾

6、病、感染性疾病胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如（如AIDS、类风湿等）。、类风湿等）。第一节 基因治疗的概念及其策略四、基因治疗的途径四、基因治疗的途径 五、基因治疗的基本程序五、基因治疗的基本程序1.目的目的基因的选择基因的选择和制备和制备 2.靶细胞的选择靶细胞的选择 生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗 体细胞基因治疗体细胞基因治疗3.转移载体的选择与细胞转染转移载体的选择与细胞转染4.外源基因的表达及检测外源基因的表达及检测第一节 基因治疗的概念及其策略目的基因的选择和制备目的基因的选择和制备 对遗传病只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型

7、基因就可被用于基因治疗。对病毒病所选择的靶基因应在病毒的生活史中起重要的作用并且该序列式特异的。确定目的基因后，多采用PCR等技术制备目的基因。靶细胞的选择靶细胞的选择生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗：即将正常基因转移到患者的生殖细胞即将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞（精细胞、卵细胞)或者早期胚胎，使其发育成正常个体。或者早期胚胎，使其发育成正常个体。体细胞基因治疗：体细胞基因治疗：即将正常基因转移到体细胞，使之表达即将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。基因产物，以达到治疗目的。靶细胞的选择必须考虑：靶细胞的选择必须考虑：最好为组织特异性细胞；最好为组织特

8、异性细胞；细胞较易获得，且生命周期较长；离体细胞较易受外源基因细胞较易获得，且生命周期较长；离体细胞较易受外源基因转化；离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较转化；离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活。易成活。目前常用的靶细胞有：造血细胞目前常用的靶细胞有：造血细胞、皮肤成纤维细皮肤成纤维细胞胞、肝细胞肝细胞、血管内皮细胞血管内皮细胞、淋巴细胞淋巴细胞、肌肉细肌肉细胞胞、肿瘤细胞肿瘤细胞转移载体的选择与细胞转染转移载体的选择与细胞转染转移载体分两大类：病毒载体与非病毒载体将目的基因导入靶细胞的方法大致可分为病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。外源基因的表达及检测

9、外源基因的表达及检测在筛选出转化子后还需要鉴定转染细胞中外源基因的表达状况。常用方法有原位杂交、Northern杂交、RNA打点杂交及免疫组织化学染色等，前几项是mRNA.后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可用于定量分析外源基因的表达状况。六、六、基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案，腺苷酸脱氢酶（ADA）基因对两位因ADA基因缺陷而导致严重免疫缺损的女孩进行治疗，获得了令人满意的结果。迄今报道已有数千例经基因治疗的患者，病种主要是恶性肿瘤，艾滋病、肺囊性纤维化等。第一节 基因治疗的概念及其策略基因治疗的病

10、毒载体必须具备以下基因治疗的病毒载体必须具备以下基本条件基本条件:1:1、携带外源基因并能包、携带外源基因并能包装成病毒颗粒装成病毒颗粒;2;2、介导外源基因的、介导外源基因的的转移和表达的转移和表达;3;3、对机体不致病。、对机体不致病。第二节 基因治疗的载体一、病毒载体一、病毒载体逆转录病毒(retrovirus，RV)载体逆转录病毒载体系统是最常使用的基因转移系统。包括重组逆转录病毒载体和包装细胞（packaging cell）两部分组成。此类载体优点是：转染谱广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞，成肌细胞，肝细胞等；一次可感染大量细胞，转染率高达100；能整合至宿主细胞基因组中，使靶细

11、胞成为稳定表达目的基因的转化细胞，故称之为转导（transduction）腺病毒腺病毒(adenovirusadenovirus，AD)AD)载体载体 腺病毒系引起上呼吸道感染的普遍双链DNA病毒。腺病毒载体主要优点是：腺病毒在自然界中广泛存在。从许多物种可以分离到腺病毒，据报道有100多个亚型，其中有43个左右的亚型是从人体中分离到的。大多数成人接触过基因治疗中广泛应用的腺病毒载体（2型和5型腺病毒）。与现有的其他载体相比，腺病毒载体可以快速感染大多数人体细胞，产生高水平的基因转移。腺病毒载体对人体致病性低，只引起极低或轻微的普通感冒相关症状。腺病毒载体可以携带较大的DNA片段（可达7.5k

12、b左右）并将之转染到非分裂细胞。腺病毒基因组很少发生重组，插入的外源基因在随后的病毒复制过程中通常能够保持稳定。运用重组DNA技术对腺病毒载体进行操作比较容易。腺相关病毒腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体载体 腺相关病毒是一种复制缺陷性细小病毒，必须与腺病毒或单纯疱疹病毒或痘苗病毒等辅助病毒共感染时才能进行有效复制和产生溶细胞性感染。其特点是：能特异地整合于人类第19对染色体的长臂中，从而减少重组AAV插入突变的危险性；AAV基因组可克隆到一个质粒中，载体构建简单；无致病性，安全性高；宿主范围广，可感染多种细胞；稳定性好，便于浓缩、纯化和灭活辅助病毒其他病毒

13、载体其他病毒载体 慢病毒（ientivims）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)具有神经细胞的嗜向性，为外源基因转染于中枢神经细胞提供了一种独特方法。1 1、裸、裸DNA把携带外源基因的表达质粒直接注射或通过基因枪、电穿孔把携带外源基因的表达质粒直接注射或通过基因枪、电穿孔导入到组织细胞中，不依赖其他物质介导，是最简单的非病导入到组织细胞中，不依赖其他物质介导，是最简单的非病毒载体系统。毒载体系统。2 2、脂质体、脂质体脂质体载

14、体是用人造双层磷脂质，包装脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体与体细胞相容，无毒无抗原性，复合物。脂质体载体与体细胞相容，无毒无抗原性，可生物降解，不会在体内堆积，可制成球状，包容大小不同可生物降解，不会在体内堆积，可制成球状，包容大小不同的生物活性分子，能适应不同的生理要求。的生物活性分子，能适应不同的生理要求。最常用的脂质体为阳离子脂质体。最常用的脂质体为阳离子脂质体。第二节 基因治疗的载体二、非病毒载体二、非病毒载体3 3、多聚物、多聚物多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷

15、的DNADNA相结相结合，形成稳定的多聚复合物，使合，形成稳定的多聚复合物，使DNADNA不易被核酸酶降解，并可与不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。4 4、分子偶联体、分子偶联体分子耦联载体由分子耦联载体由DNADNA、DNADNA结合因子和配体三部分组成。配体与结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。移至细胞内。第二节 基因治疗的载体二、非病毒载体二、非病毒载体已经发现腺苷脱氨酶基因位于染色体20

16、的长臂；1983年腺苷脱氨酶基因被克隆；应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞；新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来无该基因的淋巴细胞中表达，恢复正常功能。第三节 重要疾病的基因治疗一、开展基因工程治疗的背景一、开展基因工程治疗的背景1、麻醉后，取出病人的骨髓液，分离淋巴细胞；2、将病人的淋巴细胞与携带有腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒混合培养，经病毒感染使腺苷脱氨酶基因进入淋巴细胞；3、清洗淋巴细胞，去除多余的病毒。筛选鉴定淋巴细胞中腺苷脱氨酶基因的表达，将带有此基因的淋巴细胞输回病人体内；4、密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时重复。第三节 重要疾病的基因治疗二、二、基因治疗过程基因治疗过程1.遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗2.肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗3.病毒病的基因治疗病毒病的基因治疗第三节 重要疾病的基因治疗三、基因治疗的种类三、基因治疗的种类遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗血友病B血友病B又称乙型血友病，是一种由于血液中凝血因子缺乏而引起的严重凝血功能障碍。目前，血友病B基因治疗临床试验时安全可的，其中，腺病毒途径被认为是最有效的方法一，虽然目前的治疗效果有限，