大型底栖无脊椎动物环境DNA 监测技术规范编制说明.docx

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1、大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范（征求意见稿）编制说明大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范编制组二。二三年八月项目名称：大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范项目统一编号：20231140承担单位：北京市生态环境监测中心、中科院生态环境研究中心1标准基本情况11.1 任务来源11.2 起草单位和主要起草人12制定标准的必要性和意义12.1 管理支撑12.2 必要性和意义23主要工作过程33.1 查阅国内外标准及文献43.2 前期研究成果53.3 标准技术路线64编制原则和编制依据74.1 编制原则74.2 编制依据74.3 与现行法律、法规、标准的关系85主要条款的说明95.1

2、文件内容框架95.2 主要技术指标、参数、实验验证的论述115.3 方法应用276重大意见分歧的处理依据和结果337与国内外同类标准水平的对比情况348作为推荐性标准或者强制性标准的建议及其理由349实施标准的措施3510其他应说明的事项351标准基本情况1.1 任务来源2023年1月北京市市场监督管理局发布了北京市市场监督管理局关于印发2023年北京市地方标准制修订项目计划的通知(京市监发(2023)4号)，大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范列入2023年北京市地方标准制修订项目，项目编号：20231140o项目类别为一类，标准性质为推荐性。1.2 起草单位和主要起草人大型底栖无脊椎动

3、物环境DNA监测技术规范行业主管部门为北京市生态环境局，主要起草单位为北京市生态环境监测中心、中国科学院生态环境研究中心。主要起草人：常淼、杜泽瑞、沈秀娥、孙成华、陈圆圆、刘康、任帅、晁晶迪、马秋月、贺鑫、战爱斌、熊薇、陈义永。2制定标准的必要性和意义2.1 管理支撑拓展水生态监测能力，支撑水生态环境管理需求工作需要。生态环境部发布的生态环境监测规划纲要(2020-2035年)中提出“地表水监测要逐步实现水质监测向水生态监测的系统转变，建立以流域为单元的水生态监测指标体系和评价体系”。“十四五”重点流域水生态环境保护规划要求在长江、辽河、海河、松花江等流域开展水生生物环境DNA监测试点。生态环

4、境部发布的内陆大型底栖无脊椎动物多样性调查与评估技术规定要求在编制大型底栖无脊椎动物物种名录时要附上凭证，包括照片、DNA序列等。2020年农业农村部发布长江十年禁渔计划，以空前严格的措施实施禁渔。而传统的形态学鉴定损伤性(通常是致死性)的取样方式对所研究的生物群落造成了破坏，违背了保护生物多样性的初衷。现行的禁渔政策也不允许破坏性样品采集。北京市生态环境局印发北京市“十四五”时期生态环境监测规划要求拓展水生态监测，开展水体底栖生物在水生态补偿领域的应用研究，研究水环境生态标识物监测指标，探索开展水生生物自动识别、水生态流量监测，为水生态监测指标纳入本市水生态环境区域补偿监测体系奠定基础。提升

5、水生态监测能力，探索应用环境DNA宏条形码生物多样性技术，开展水生生物的分子生物学快速鉴定技术研究，初步构建本地化水生生物DNA条形码数据库。2.2 必要性和意义现行标准和技术规范不足以支撑北京市水生态环境管理工作需要。大型底栖无脊椎动物形态学鉴定监测需要借助专业设备，不利于开展大规模的现场调查。大型底栖无脊椎动物采样需要借助专业的采泥器、踢网、D形网、索伯网、人工基质篮式采样器和十字采样器等，点位选择及采样人员的经验直接影响大型底栖无脊椎动物样品的采样和物种鉴定质量。这种损伤性（通常是致死性）的取样方式对所研究的生物群落造成了破坏，违背了保护生物多样性的初衷。此外，随着监测技术的发展和环境管

6、理需求的变化，使用形态学鉴定的方法进行水生物种多样性监测逐渐暴露出很多局限性：（1）采样要求高，监测效率低。一次采样难以全面准确的采集到合格的样品，造成样品代表性差；（2）分类鉴定过于依赖专家的经验，对研究人员的经验要求较高，鉴定与分类结果的正确性缺乏依据，质控困难；（3）在生活史早期阶段的大型底栖无脊椎动物及高度近缘的大型底栖无脊椎动物类群往往难以辨别，特定发育阶段及不同性别的样品往往难以辨别，影响鉴定结果的准确性等。传统监测方法的局限性使其难以适应目前水质监测要求的高频率、大规模、高要求的监测和管理需求。因此，亟需建立高灵敏度、高准确度、高效率、代表性更好的新型水生生物监测技术和方法。环境

7、DNA（environmentalDNA,环境DNA）是从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNAo环境DNA监测方法通过高通量测序技术获取样品中生物物种组成，能够快速、准确、大规模地得到生物群落结构组成和多样性信息，极大的拓展了生物多样性调查方法,现已被广泛应用于水生态环境的生物多样性监测中。相对于传统的野外调查监测方法，环境DNA技术具有其独特的优势：（1）采样方法简单，省时省力。相对于传统的采样方法，采集水样耗时少、成本低。（2）无损伤采样。相对于传统的捕获式采样，环境DNA技术只需要采集生物栖息地的水样，并不会危害到目标物种或者采集区域内的其他

8、物种，对采样点周围的生态系统干扰较少。（3）不依赖动物样本。克服了传统的动物野外调查方法对动物样品自身的依赖性，避免了未遇见或未采集样本而造成对物种多样性及其分布状况的低估或误判。（4）采样受限小。由于环境DNA主要采集水样，与传统的调查监测方法相比，在采样环节对环境要求低，可以最大限度地降低因天气状况、水位、物候等环境条件变化对采样的影响和限制。（5）灵敏度高，样品代表性强。即使在物种密度很低的情况下也能准确检测到目标物种的存在。研究表明对于监测淡水水生生物，尤其是外来入侵或者濒危乃至稀有动物，其灵敏度要高于传统的监测方法。（6）快速和高效检测群落多样性。结合高通量测序技术的环境DNA宏条形

9、码方法可以在短时间内对混合的环境样品包含的所有物种进行识别和检测，具有大尺度、大样本生物多样性监测的潜力。（7）流程的标准化程度高，便于质量控制。有利于制定规范的鉴定标准，克服了传统方法受样品条件限制、操作者实践经验和专业知识等限制。基于此，环境DNA技术已成为高灵敏度、高准确度、高效率、代表性更好和标准化的新一代生物多样性监测方法。环境DNA监测集成了样品采集、环境DNA提取、PCR扩增、测序、生物信息学分析等一系列操作的综合技术体系，监测的结果也会受到诸多方面的影响，规范标准的操作流程是成功和准确开展环境DNA监测的关键。大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范的制定将为在全市范围内进行大

10、型底栖无脊椎动物环境DNA监测提供统一的技术标准，满足国家与北京市对于拓展水生态监测，提升水生态监测能力的技术需求。3主要工作过程北京市生态环境监测中心接到北京市地方标准制修订项目计划任务后，于2022年成立了标准编制组，编制组由从事大型底栖无脊椎动物监测和环境DNA监测相关技术人员组成。2022年1月5月，梳理完成了2020年8月2021年12月北京市典型水体底栖无脊椎动物环境DNA监测结果，整理分析北京五大水系60余个点位底栖无脊椎动物名录和构建的98种北京市本地大型底栖无脊椎动物条形码数据库。总结环境DNA监测底栖无脊椎动物发现的问题及规律，提出大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范研

11、究总体技术路线，建立科学可行的基于环境DNA技术的北京市典型水体底栖无脊椎动物监测的程序、方法。2022年6月12月，完成了方法技术参数研究和论证工作，编制完成了环境DNA技术的淡水底栖无脊椎动物监测技术规范申报书和标准文本草案，申报立项。开展方法应用和相关技术的实际验证工作，继续补充北京市本地大型底栖无脊椎动物条形码数据库，累计154种。2023年1月，标准获批立项，召开了专家研讨会，会上就大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范的采样介质、引物等核心技术问题进行了专家质询和讨论。2023年2月3月，开展了方法核心参数验证实验和实际样品采集分析，继续修改完善标准文本草案和编制说明。2023年

12、4月5月，召开了两次专家咨询会，专家建议1、重点关注深水型湖库（密云水库）开展不同深度水样的系统研究，确定深水型湖库环境DNA采样方式。2、增加阳性样品验证实验。2023年6月7月，根据专家意见，补充采集了深水型湖库样品，补充了阳性样品验证实验，修改完善了地标草案文本及编制说明，2023年7月9月，召开专家研讨会，汇总专家会意见对标准进行修改，编制组召开内部讨论会，完善了本标准的内容，形成大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范（征求意见稿）及编制说明。3.1 查阅国内外标准及文献3.1.1 国内应用进展2019年至今，中国环境总站和各省市级监测站陆续开展了基于环境DNA的水生生物监测试点应用

13、O中国环境总站在2021年启动了长江流域鱼类环境DNA试点监测、通量试点监测及水生生物样品采集项目。北京市等省级环境监测机构相继建立环境DNA分子生物学实验室，购置了相关仪器设备，建立了环境DNA监测能力开展试点监测。3.1.2 国外应用进展环境DNA技术最早在2008年由美国开始探索研究，环境DNA最初被用来监测水生生态系统的生物入侵。如美国牛蛙(FiCetoIaetal,2008)、亚洲鲤鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)(Jerdeetal,2013)大西洋Sl(Cyprinuscarpio)(Takaharaetal,2012)水生腹足类(PotamOPyrgU

14、Santipodarum)(Goldbergetal,2013)、克氏原螯虾(PrOCambarUSClarkii)(TregUieretal,2014)等入侵物种的监测，上述研究证实了环境DNA技术的可行性。综上所述，环境DNA监测方法在国内外正处在快速发展阶段，随着方法技术发展和标准化，未来将为水生生物调查监测和水生态环境评价提供了重要的技术支撑。3.2 前期研究成果北京市生态环境监测中心20世纪70年代末至本世纪初对北京市水源地、游览水域、市区下游主要河道和主要湖泊水库进行大型底栖无脊椎动物群落监测。编写了国控点及重点水域实施生物监测方法的可行性、昆明湖及”六海”部分水域水生生物群落调查

15、报告等技术报告。先后承担过北京市生态环境局组织实施的密云水库水质保护技术研究课题、水利工程等人为活动对北京市部分水域水生生物群落影响等多项课题。2020年开始联合中科院生态环境研究中心实施北京市五大水系水生生物调查监测与水生态环境状况评价、基于环境DNA技术的北京市典型水体水生生物多样性监测和水生态环境状况评估、水环境生态监测与评价项目基于环境DNA水生生物多样性监测及评估项目。每年选择不同水体类型(河流湖库)，在山区、平原布设60余个点位开展环境DNA水生生物监测，至今已开展7轮调查监测。前期开展的常规大型底栖无脊椎动物监测和调查工作，积累了大量基础数据，掌握了北京市各个流域各类水体中大型底栖无脊椎动物分布状况，验证了环境DNA布点采样方法、选择了适合北京市流域大型底栖无脊椎动物监测的通用引物，并开展了基于环境DNA技术的大型底栖无脊椎动物水生态状况评估工作。截至目前，已取得的成果包括两部分：（1）在北京市五大水系采集了大型底栖无脊椎动物样品，获得了北京地区大型底栖无脊椎动物基础监测数据。构建了北京地区典型水域的大型底栖无脊椎动物条形码数据库，包括环节动物门，节肢动物门，软体动物门共154个物种。通过样品采集、清理、鉴定、浸制，共得到大型生物标本50余种，包含虾类，贝类和水生昆虫。（2）基于环境DNA技术获得了2020-2023年北京市五大水系60余个点位大型底栖无脊