第4章基因重组端粒与端粒酶ppt课件名师编辑PPT课件.ppt

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1、 端粒与端粒酶端粒与端粒酶 早在早在30年代，两名遗传学家年代，两名遗传学家Muller和和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，要，Muller将这一结构命名为将这一结构命名为端粒（端粒（telomere）。直到直到1985年年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的的结构为极简单的6个核苷酸个核苷酸TTAGGG序列的多次序列的多次重复后发现了重复后发现了端粒酶端粒酶(telomerase TRAP-eze)。

2、端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白复合体复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳以维持端粒长度的稳定性。定性。许多研究表明许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰

3、老。胞增殖、癌变、凋亡、衰老。第一节第一节 端粒与端粒酶端粒与端粒酶一、端粒的结构与功能一、端粒的结构与功能 1972年年James Watson提出了提出了“复制末端问复制末端问题题”，复制，复制DNA的的DNA多聚酶并不能将线性染色多聚酶并不能将线性染色体末端的体末端的DNA完全复制。也就是说在线性完全复制。也就是说在线性DNA复复制时，制时，DNA多聚酶留下染色体末端一段多聚酶留下染色体末端一段DNA（一（一段端粒）不复制。段端粒）不复制。端粒端粒DNA复制的特点是在每次复制的特点是在每次DNA 复制中，复制中，每条染色体的每条染色体的3端均有一段端均有一段DNA无法得到复制，无法得到复

4、制，随着细胞每次分裂，染色体随着细胞每次分裂，染色体3一末端将持续丧失一末端将持续丧失50-200bp的的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分分裂时钟裂时钟”，反映细胞分裂能力。，反映细胞分裂能力。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这

5、个规则渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。胞亦如此。端粒端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。是真核细胞线性染色体末端特殊结构。由端粒由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。和端粒相关蛋白组成。端粒端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列为不含功能基因的简单、高度重复序列,在生物进化过程中具有高度保守性。在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒不同物种的端粒DNA 序列存在差异序列存在差异。人类及

6、其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列,长约15kb。体细胞的端粒有限长度（telomere restriction fragments TRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。端粒端粒DNA由两条互相配对的由两条互相配对的DNA 单链组成单链组成,其其双链部分通过与端粒结合蛋白质双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和和TRF2 结合结合共同组成共同组成t环环(t loops)。这种。这种t 环特殊结构可维持染色环特殊结构可维持染色体末端的稳定体末端

7、的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性保持染色体及其内部基因的完整性,从从而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。能稳定存在。端粒端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶的一顶“帽子帽子”，它既可保护染色体不被降解，又，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（避免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染色体）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞

8、“分裂时分裂时钟钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。二、端粒酶的结构与功能二、端粒酶的结构与功能 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危）的危险。因 此 在 正 常 人 体 细 胞 间 永 生 化 细 胞险。因 此 在 正 常 人 体 细 胞 间 永 生 化

9、细 胞（immortalized cells）及肿瘤细胞的转化过程中可）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们具备的功能，能使已缩短

10、的端粒延长，使科学家们兴奋的是到兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶端粒延长的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。端粒酶的结构端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由由RNA RNA 和结合的蛋白质组成和结合的蛋白质组成,是是RNARNA依赖的依赖的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒一种特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶,通过明显的模板依赖通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒

11、酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白（端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一个被克隆的端粒酶是第一个被克隆的端粒酶组分。组分。端粒酶端粒酶RNARNA含有与同源端粒含有与同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互补序列的互补序列,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板区切割此模板区,能使体外消除端粒酶能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。延长端粒的功能。人类人类TERTTE

12、RT（hTERThTERT）基因为一单拷贝基因）基因为一单拷贝基因,定位于定位于5p15.33,5p15.33,具有具有7 7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T T。破坏破坏TERT TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。将消除端粒酶活性并致端粒缩短。TEP1TEP1、生存动力神经细胞基因生存动力神经细胞基因(SMN)(SMN)产物产物、hsp90hsp90、PinX1PinX1、Est1p Est1p 和和Est3pEst3p 1 1、端粒酶、端粒酶RNA(hTERT)RNA(hTERT)哺乳动物端粒酶哺乳动物端粒酶RNAs(hTRR

13、NAs(hTR和和mTR)mTR)在许多组织的不在许多组织的不同发育阶段同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。表达。体内端粒酶体内端粒酶RNA RNA 的存在对端粒酶功能至关重要，的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶影响到端粒酶RNA RNA 的稳定性与突变的稳定性与突变,也可改变体内端也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。端粒酶RNA转录模板远端区远端区参与和底物的结合。近端区近端区能添加特定的核苷

14、酸,对底物识别并不重要。模板边界区模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku 结合。2 2、端粒酶逆转录酶、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse(Telomerase reverse transcriptase,TERT)transcriptase,TERT)几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT TERT 基因基因,哺乳动物哺乳动物TERT TERT 的转录由许多转录因的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因不同的转录因子调节子调节hTERThTERT

15、在不同的细胞内含物中的表达。癌基在不同的细胞内含物中的表达。癌基因因c-mycc-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因,并可与并可与H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒、多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基因协同作用因协同作用,促进细胞无限增殖促进细胞无限增殖,获得永生化并获得永生化并发生癌变。发生癌变。c-myc c-myc 与与hTERThTERT FujimotoFujimoto等用等用c-myc c-myc 反义寡核甘酸转染白血病反义寡核甘酸转染白血病细胞细胞后后,这些细胞这些细胞中中端粒酶活性均能被下调端粒酶活性均能被下调,而而

16、c-c-myc myc 正义寡核甘酸无此作用。正义寡核甘酸无此作用。WangWang等研究发现等研究发现c-mycc-myc在正常人乳腺上皮细胞和在正常人乳腺上皮细胞和二二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性,并能延长并能延长这些这些细胞细胞的寿命。因此认为癌基因的寿命。因此认为癌基因c-mycc-myc为一重要的端粒为一重要的端粒酶激活剂酶激活剂。存在于存在于hTERThTERT核心启动子中有两个重要的核心启动子中有两个重要的c-myc c-myc 结合位点结合位点(CACGTG,(CACGTG,亦被称为亦被称为E E 盒盒)。c-myc c-myc 诱导的诱导的hTERT hTERT 表达起始速度快表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影响合成的影响,与与c-myc c-myc 引起的直接的转录激活一致。引起的直接的转录激活一致。但癌基因但癌基因c-myc c-myc 不是唯一与不是唯一与hTERThTERT基因调节有关的转基因调节有关的转录因子。录因子。近期研究表明近期研究表明,Sp1,Sp1 协同协同c-myc c-myc