第2章蛋白质和主要必需氨基酸的测定.ppt

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1、l蛋白质是植物的重要组成成分，也是蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重农产品品质中最重要的成分要的成分。l它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽其中以籽粒中最多粒中最多，如豆类可达，如豆类可达45-55，其次是花、叶、茎和，其次是花、叶、茎和根。根。l作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组织输送，在接近成熟时期，茎叶中的氮向贮存器官输送，织输送，在接近成熟时期，茎叶中的氮向贮存器官

2、输送，合成的蛋白质集中于合成的蛋白质集中于种子种子中。中。作物作物蛋白质蛋白质（干基）（干基）作物作物蛋白质蛋白质（干基）（干基）作物作物蛋白质蛋白质（干基）（干基）作物作物蛋白质蛋白质（干基）（干基）菜豆菜豆洋扁豆洋扁豆速豌豆速豌豆蚕豆蚕豆大豆大豆亚麻亚麻向日葵向日葵(仁仁)棉籽棉籽(仁仁)小麦小麦黑麦黑麦15.030.524.634.122.034.027.035.029.450.42.030.821.130.228.642.019.330.014.424.1大麦大麦燕麦燕麦稻米稻米玉米玉米小米小米(仁仁)高梁高梁荞麦荞麦(仁仁)10.620.48.017.37.814.59.013.21

3、0.221.59.515.312.819.0马铃薯马铃薯冬油菜冬油菜甜菜甜菜萝卜萝卜胡萝卜胡萝卜洋葱洋葱大蒜大蒜菠菜菠菜芹菜芹菜番茄番茄0.72.71.01.50.71.40.61.20.61.91.92.86.72.31.33.60.30.8茄茄辣椒辣椒南瓜南瓜黄瓜黄瓜甘蓝甘蓝花椰菜花椰菜浆果浆果核桃核桃高梁叶高梁叶高梁茎高梁茎0.61.20.71.10.41.00.50.91.22.62.40.31.916.128.912.417.54.07.5l蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产品品质和营养价值的重要指标。品品质和营养价值

4、的重要指标。l测定植物各部分中蛋白质的含量，对其测定植物各部分中蛋白质的含量，对其品质鉴定、品种选品质鉴定、品种选育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋白质含量白质含量等有重要意义。等有重要意义。l对产品加工方式及其产品质量有影响。对产品加工方式及其产品质量有影响。l在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。为什么要测定蛋白质？为什么要测定蛋白质？l氨基酸是组成蛋白质的基本单位氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。，也是蛋白质的分解产物。l氨基酸的分析测定是

5、研究蛋白质、酶的化学组成及性质的氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。重要手段。l动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸两种。两种。l“第一、第二限制氨基酸第一、第二限制氨基酸”的赖氨酸和色氨酸的赖氨酸和色氨酸，是必需氨，是必需氨基酸，但基酸，但人类和动物自身无法合成人类和动物自身无法合成，须从食物中直接吸收。，须从食物中直接吸收。l氨基酸的含量是衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。氨基酸的含量是衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。为什么要测定氨基酸？为什

6、么要测定氨基酸？l蛋白质的分析方法很多，可分为两类：蛋白质的分析方法很多，可分为两类：(1)利用蛋白质的共性，即利用蛋白质的共性，即含氮量；含氮量；(2)利用蛋白质中利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸特定氨基酸残基、酸(碱碱)性基团和芳香基团性基团和芳香基团测测定蛋白质含量。定蛋白质含量。l最常用的方法是最常用的方法是开氏（凯氏）法开氏（凯氏）法测定含氮量。测定含氮量。l粗蛋白质：粗蛋白质：开氏法测定结果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白开氏法测定结果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白质氮，故称质氮，故称“粗蛋白质粗蛋白质”l纯蛋白质：纯蛋白质：开氏法测定中，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离开氏法测定中，如

7、果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质纯蛋白质”。l籽粒中粗蛋白质的测定l同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法)l同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法)H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（开氏法）消煮法（开氏法）l方法原理方法原理：植物中的蛋白质含量基本上是不变的。植物中的蛋白质含量基本上是不变的。可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数，即得粗蛋白质含量。质换算系数，即得粗蛋白质含量。l换算系数：换算系数：平均平均

8、6.25蛋白质平均含氮蛋白质平均含氮16%，不，不同植物籽粒换算系数见同植物籽粒换算系数见P286表表14-2。l籽粒样品在开氏法分解时，籽粒样品在开氏法分解时，硝态氮的部分氨化硝态氮的部分氨化是不可是不可避免的。避免的。l因此，因此，蔬菜类蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用需要用水杨酸固定硝态氮化合物水杨酸固定硝态氮化合物，然后用开氏分解测，然后用开氏分解测定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋即得蛋白质

9、含量。白质含量。l开氏法开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。用于测定各种形态的有机氮。l设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷物化学协会物化学协会(ICC)和美国分析化学家协会和美国分析化学家协会(AOAC)以及以及我国都把开氏法作为我国都把开氏法作为标准标准的分析方法。的分析方法。l

10、开氏法开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔于是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。机氮。l开氏定氮法：开氏定氮法：(Kjeldahl determination)：在：在，即可计算出样品，即可计算出样品中的氮量。中的氮量。有机氮有机氮铵盐铵盐NH3NH4+l开氏法也有开氏法也有缺点缺点，主要是，主要是操作手续较繁，分析的速度操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高较慢，试剂费用较高。l近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动

11、或半自动的开氏定氮仪。动的开氏定氮仪。l瑞典的瑞典的Tecator公司生产的开氏公司生产的开氏1030分析仪分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的、日本生产的kjel-Auto自动氮和自动氮和蛋白质分析仪和丹麦蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的公司生产的KjelFOSS自自动蛋白质分析仪等。动蛋白质分析仪等。l消煮炉或电炉消煮炉或电炉l消煮管消煮管(或开氏瓶或开氏瓶)100mL或或50mLl半微量定氮装置半微量定氮装置l半微量滴定管半微量滴定管 l20 gL-1 H3BO3指示剂溶液：称取指示剂溶液：称取H3BO3(分析纯分析纯)20g溶于溶于1L水中。每

12、升水中。每升H3BO3溶液加甲基红溶液加甲基红-溴甲酚绿混合溴甲酚绿混合指示剂指示剂20mL，并用稀酸或稀碱调节至紫红色，并用稀酸或稀碱调节至紫红色(pH=4.5)。l0.01 molL-1(1/2H2SO4)或或0.02 molL-1 HCl标准溶液。标准溶液。l其他试剂同其他试剂同第四章第四章(土壤全氮的测定土壤全氮的测定)。(1)样品的消煮样品的消煮 称取烘干样品称取烘干样品(过过0.25mm筛筛)0.3000 0.5000g置于置于50mL或或100mL开氏瓶或消煮管中，加入开氏瓶或消煮管中，加入混合催化剂混合催化剂1.8g，加几滴水，加几滴水湿润后，加湿润后，加5mL浓浓H2SO4，

13、小心轻摇后，小心轻摇后(最好加塞放置过夜最好加塞放置过夜)，盖上盖上小漏斗小漏斗，将消煮管放置在，将消煮管放置在消煮炉消煮炉上，开始时用小火加热，上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约色时，再加热约10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损，取下冷却至温热时，将消煮液无损地转入地转入100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。（2）氮的测定）氮的测定 用移液管吸取澄清待测液用移液管吸取澄清待测液5.00或或10.00mL放入半微放入半微量定氮仪中进行定

14、氮。同时作空白试验和核对试验。量定氮仪中进行定氮。同时作空白试验和核对试验。见教材见教材P46半自动半自动l氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用6.25，这是由蛋，这是由蛋白质平均含氮白质平均含氮16%为根据导出的值，但不同植物籽粒中为根据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有蛋白质的含氮量有差异差异，故由氮换算为蛋白质的系数也，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同，稍有不同，P286。l以以定量蛋白质为目的的总氮量测定定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法分解时，中，开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜类蔬菜

15、类特别是可特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态水杨酸固定硝态氮化合物氮化合物，用开氏分解测定总氮量，用开氏分解测定总氮量;同时用同时用其他方法其他方法测测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。质换算系数即得蛋白质含量。注意问题注意问题l本法测定的结果为本法测定的结果为粗蛋白质粗蛋白质的含量。的含量。l如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、淀剂碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200gL-1

16、250gL-1单宁或单宁或100gL-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得：的换算系数即可得：“纯蛋白质纯蛋白质”量。量。注意问题注意问题 蛋白质中的蛋白质中的碱性氨基酸碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在在pH=23的酸性缓的酸性缓冲液体系中呈冲液体系中呈阳离子状态阳离子状态存在，可以和存在，可以和偶氮磺酸染料类偶氮磺酸染料类物质物质如如橘黄橘黄G等的阴离子结合，形成等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质不溶于水的蛋白质-染料络染料络合物合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。l主要仪器主要仪器