实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx

上传人:王** 文档编号:601719 上传时间:2023-12-08 格式:DOCX 页数:7 大小:33.92KB
下载 相关 举报
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第1页
第1页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第2页
第2页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第3页
第3页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第4页
第4页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第5页
第5页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第6页
第6页 / 共7页
实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx_第7页
第7页 / 共7页
亲,该文档总共7页,全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述

《实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实时荧光定量-PCR-详细操作步骤流程.docx(7页珍藏版)》请在优知文库上搜索。

1、实时荧光定量PCR详细操作步骤流程原理实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。步骤一、样品RNA的抽提1. 取冻存己裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。2. 两相分离每IInl的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%o3. RNA沉淀将

2、水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30孵育10分钟后,于4下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。4. RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZ0L试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH20配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4C下7000rpm离心5分钟。5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水4Oul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80C待

3、用。二、RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。(1)浓度测定A260下读值为1表示40ugRNAmlo样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260X稀释倍数X40ug/ml0具体计算如下:RNA溶于40ulDEPC水中,取5ul,1:100稀释至495Ul的TE中,测得A260=0.21RNA浓度=0.21X100X40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5Ul用来测量以后,剩余样品RNA为35ul,剩余RNA总

4、量为:35ulX0.84ug/ul=29.4ug(2)纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定(1)制胶1. g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60,10ml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)0IOxMOPS电泳缓冲液配方后台回复“配方”联系灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的IXMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。需PCR缓冲液“配方”后台留言(2)准备RNA样品取3UgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中

5、至终浓度为10ug/mlO加热至70孵育15分钟使样品变性。(3)电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6Vcm电压下2h,电泳至浸酚兰指示剂进胶至少2-3cmo(4)紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更

6、高分子量的弥散迁移物质或者带,弥散。用数码照相机拍下电泳结果。需PCR缓冲液“配方”后台留言三、样品CDNA合成1.反应体系RNA的降解表现为核糖体RNA带的序号反应物1逆转录buffer剂量2ul2上游引物0.2ul3下游引物0.2ul4dNTP0.1ul5逆转录酶MMLV0.5ul6DEPC水7RNA模版5ul2ul8总体积10ul轻弹管底将溶液混合,6OOOrpm短暂离心。2. 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5ul,37水浴60分钟。3. 取出后立即95干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为CDNA溶液,保存于-80待用。

7、四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(B-actin)实时定量PCR1.-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27Ul并充分混匀)为Iol0,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。2.反应体系如下:标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2阳性模板上游引物F0.5ul3阳性模板下游引物R0.5ul4dNTP0.5ul5Taq酶1ul6阳性模板DNA5ul7ddH2O32.5ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合,6OOOrpm短暂离心。3.管家基因反应体系:序号反应物剂量1SYBR

8、Green1染料10ul2内参照上游引物F0.5ul3内参照下游引物R0.5ul4dNTP0.5ul5Taq酶1ul6待测样品cDNA5ul7ddH2032.5ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。3.制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:932分钟,然后931分钟,552分钟,共40个循环。五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1.针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的CDNA模板进行PCR反应。2.反应体系序号反应物剂量1lO×PCR缓冲液2.5ul2MgC12溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNT

9、P混合液3ul6Taq聚合酶1ul7CDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合,600OrPm短暂离心。35个PCR循环(94Cl分钟;55Cl分钟;721分钟);72?C延伸5分钟。(3) PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,溟化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。(4)将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为l×IOl0,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、待测样品的待测基因实时定量PCR1. 所有CDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。2. 体系配

10、置如下:序号反应物剂量SYBRGreen1染料上游引物下游引物Taq聚合酶待测样品CDNA轻弹管底将溶液混合,6OOOrpm短暂离心。(3)将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:932分钟预变性,然后按931分钟,551分钟,72Cl分钟,共40做个循环,最后727分钟延伸。需PCR缓冲液“配方”后台留言七、实时定量PCR使用引物列表引物设计软件:PrimerPremier5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和

11、管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。注意事项:1 .荧光阈值:在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量标准)。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上,但实际应用要结合扩增效率,线性回归系数等参数来综合考虑。2 .Ct值:在PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。常见问题:实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,

12、通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。3 )Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > IT计算机 > 图形图像

copyright@ 2008-2023 yzwku网站版权所有

经营许可证编号:宁ICP备2022001189号-2

本站为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。装配图网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知装配图网,我们立即给予删除!