第13章基因工程与PCR名师编辑PPT课件.ppt

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1、目录目录重点内容：1.说出基因工程的操作步骤说出基因工程的操作步骤2.列出基因工程的主要工具酶列出基因工程的主要工具酶3.简述简述PCR技术的工作原理技术的工作原理4.列出列出PCR的操作步骤的操作步骤 学时分配学时分配 第一节第一节 2学时学时第二节第二节 1学时学时 基因工程又称重组基因工程又称重组DNA技术，是对携带遗技术，是对携带遗传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域的学科领

2、域生物技术工程。生物技术工程。（一）（一）DNA克隆克隆 所谓克隆所谓克隆(clone)就是来自同一始祖的就是来自同一始祖的相同拷贝相同拷贝(copy)的的集合；获取同一拷贝的的的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无性繁殖过程获得的性繁殖过程获得的“克隆克隆”，可以是分子的，可以是分子的，也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子遗传学领域所谓的分子克隆专指遗传学领域所谓的分子克隆专指DNA的克的克隆。隆。DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质源

3、的遗传物质同源的或异源的、原核的或真核的、同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNA与载体与载体DNA结合成一具有自我复结合成一具有自我复制能力的制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既分子，既DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增特异性基因，因此特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆克隆又称基因克隆(gene c

4、loning)。克隆某一基因或克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源片段过程中，将外源DNA插入载插入载体分子所形成的复制子是杂合分子体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合嵌合DNA，所，所以以DNA克隆或基因克隆又称重组克隆或基因克隆又称重组DNA。实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重组组DNA技术，又称基因工程。技术，又称基因工程。（二）工具酶（二）工具酶 在重组在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。因操作。1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别限制性核酸内切酶能识别特异的特异的DNA

5、序列，并在识别位点或其周围切割双序列，并在识别位点或其周围切割双链链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离株分离出的第一种限制酶命名为出的第一种限制酶命名为Bam H）。）。下表：限制性核酸内切酶5G GATCC35A GATC

6、T35G AATTC35A AGCTT35G CGG35 GATC35GA TATG3 名 称识别序列及切割位点切割后产生5突出末端：BamH Bgl EcoRHind Hpa Mbo Nde 续表：限制性核酸内切酶名 称识别序列及切割位点切割后产生3突出末端：Apa HaeKpn Pst Sph 切割后产生平末端：Alu EcorHaePvu Sma 5 GGGCC C 35 PuGCGC Py 35 GGTAC C 35 CTGCA G 35 GCATG C 35AG CT 35 GAT ATC 35 GG CC 35 CAG CTG 35 CCC GGG 3 2DNA连接酶连接酶 DNA

7、连接酶催化DNA分子中相邻的5磷酸基和3羟基末段之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。3 DNA聚合酶聚合酶 其作用是：合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端 4 4Klenow片段片段 又名DNA聚合酶大片段，具有完整的DNA聚合酶的 5 3聚合、3 5外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA 3末端标记等 5 5反转录酶反转录酶 其作用是：合成cDNA 替代DNA聚合酶进行填补、标记或DNA序列分析 6 6多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或 标记探针 7末端转移酶末端转移酶 在3羟基末端进

8、行同质多聚物加尾 8碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 （三）目的基因（三）目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。cDNA是指经反转录合成的与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA。（四）基因载体（四）基因载体 基因载体或称克隆载体，是为携带感基因载

9、体或称克隆载体，是为携带感兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。可充当基因载体的分子。可充当基因载体的DNA分子有分子有质粒质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA和病毒和病毒DNA。它们。它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。有表达外源基因的能力。所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链链DNA分子分子,小的小的23kb，大的可达数百，大的可达数百kb。质粒分。质粒分子本身是含有复制功能

10、的遗传结构，能在宿主细胞子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒DNA的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操操作，如扩

11、增、筛选过程中都是极为有用的。作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。pBR322质粒是稍早构建的质粒载体，其质粒是稍早构建的质粒载体，其DNA分子中含有单个分子中含有单个EcoR限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶位点，可在此插入外源基因。此外还含有位点，可在此插入外源基因。此外还含有ter 和和 amp两个两个抗药基因（分别为抗四环抗药基因（分别为抗四环素抗氨苄青霉素）素抗氨苄青霉素）。这个质粒还含有一个复。这个质粒还含有一个复制起始点（制起始点（ori）及及DNA复制调节有关的序复制调节有关的序列，赋予列，赋予pBR322质粒复制子特性（见下页图质粒复制子特性（见下页图示）。示）。常用作克隆载

12、体的噬菌体常用作克隆载体的噬菌体DNA有有噬菌噬菌体和体和M13噬菌体。噬菌体。pBR322质粒复制起始点酶切位点抗药基因 一个完整的一个完整的DNA克隆过程应包括：克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的构建，目的基因的获取，基因载体的构建，目的基因与载体的拼接，重组目的基因与载体的拼接，重组DNA分分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。以重组分子的受体细胞（转化子）。以质粒为载体的质粒为载体的DNA克隆过程如下页图克隆过程如下页图所示：所示：下图：以质粒为载体的DNA克隆过程 载体目的基因重组DNA分子转化细菌含重组DNA分子的细

13、菌重组DNA分子增殖 细菌在培养液中 繁殖后，在固体 培养基中生长筛选含重组质粒的细菌 （一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 1化学合成法化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列可以如果已知某种基因的核苷酸序列可以利用利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。合成仪通过化学合成法合成目的基因。2基因组基因组 DNA文库文库 分离细胞染色体分离细胞染色体DNA，利用限，利用限制性内切核酸酶将染色体制性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组载

14、体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体分子内可能存在不同的染色体DNA片段，片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代表片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组所有基因组DNA的集合称基因组的集合称基因组 DNA文库。基因组文库。基因组 DNA文库就像图书馆库存万卷书一样，涵

15、盖了基因组全部基因文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因组信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因组 文库后需文库后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，在行扩增，将重组的菌落，在行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基分离、回收，获得目的基因的无因的无 性繁殖性繁殖克隆（见下页图）。克隆（见下页图）。真核生物染色体DNA限制性内切核酸酶剪切20kbDNA片段与载体连接引入宿主细胞基因组DNA克隆上图:基因组DNA文库的构建 3 cDNA文库文库 以以mRNA为模板，利用为

16、模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA（cDNA），再复制成双链），再复制成双链cDNA片段，与片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（见下页图示）。由文库（见下页图示）。由mRNA制作的制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种文库包含了细胞表达的各种mRNA信信息，自然也含有我们感兴趣的编码息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。然后，采用适当方法从然后，采用适当方法从cDNA文库中筛选出文库中筛选出目的目的cDNA。当前发现的大多数蛋白质的。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。编码基因几乎都是这样分离的。组织或培养细胞 载体mRNAcDNAcDNA与载体DNA连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特性上图：构建上图：构建cDNA文库示意图文库示意图 4聚合酶链反应聚合酶链反应 目前，已广泛采用聚目前，已广泛采用聚合酶链反应（合酶链反应（PCR）获取目的）获取目的DNA。PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组的基因组DNA或或cDNA的专门技术（见