第13章基因工程和基因组学.ppt

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1、12 1971,美国史密斯美国史密斯,细菌细菌,限制酶限制酶;1972,伯格伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与与噬菌体噬菌体DNA,DNA,用用DNADNA连接酶连接连接酶连接,新的新的DNADNA分子分子;1973,1973,科恩将重组外源科恩将重组外源DNADNA片段与质粒连接起来片段与质粒连接起来,重组质重组质粒粒,转入大肠杆菌转入大肠杆菌;1974,1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达;1982,1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进入市场入市场;1985,1985

2、,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功;1986,1986,基因工程生物实验性地释放到环境中基因工程生物实验性地释放到环境中;19901992,头一个转基因小麦头一个转基因小麦,玉米玉米;1994,基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市;1996,克隆羊多利诞生克隆羊多利诞生.现在现在,利用基因工程技术创建新的生命形态利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品生产药品,疫苗疫苗,牛奶和食品牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病诊断和治疗遗传疾病.3第一节第一节基因克隆所需要的酶基因克隆所需要的酶4一、限制性内切核酸酶1、限制性内切核酸酶的发现和

3、限制性修饰现象限制作用修饰作用 G AATTC CTTAAG GAATTCEcoRMEcoR限制性内切核酸酶EcoR和甲基化转移酶进行限制和修饰作用图解/EcoR CTTAAG CTTAA G GAATTC52、型限制性内切核酸酶EcoB：识别序列 T-G-A-（N）8-T-G-C-T；甲基化的位点 第3或第9腺嘌呤Ecozk：识别序列 A-A-C-（N）6-G-T-G-C；甲基化的位点 目前还不清楚特点：1kb左右距离进行随机切割，70个左右的核苷酸，基因工程中运用极为有限63、型限制性内切核酸酶2300多种，可识别230多种不同的DNA序列，基因工程中运用十分广泛。特点：（1）：能够识别特

4、异性的DNA识别位点，这种识别位点通常是具有双链回文对称的结构；（2）：切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能够重新连接；（3）：切割和修饰功能由两种不同的酶催化所完成；（4）：切割不需要ATP和SAM作为活性催化因子。73-CTTAA-53-G-55-G-35-AATTC-3 3-CTTAAG-5 5-GAATTC-3EcoR切割双链DNA产生5突出的黏性末端例如：EcoR;Hind;BamH;Pst;Xho（黏性末端）Sma;Xma （平头末端）Sfi Mbo;Hph 3-GGG-53-CCC-55-CCC-35-GGG-3 3-GGGCCC-55-CCCGGG-3Sma切割双链DNA

5、产生5突出的平头末端84、型限制性内切核酸酶与型极为相似，EcoP 1 EcoP 1 5，运用极为有限。特点：（1）：具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的；（2）：切割位位点通常位于识别位点的3一侧25个碱基处进行单链切割DNA分子；95、其他限制性内切核酸酶目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和4-甲基胞嘧啶DNA分子的限制性内切酶,McrBC。106、限制性内切核酸酶的命名和分类几条基本原则：（1）：利用属名的第一个字母和种名的前2个字母代表内切酶的来源。Escherichia coli,Eco;Haemophilus

6、 influenzae,Hin;（2）：内切酶的第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。EcoRI中的R就表示该内切酶来自于大肠杆菌的R菌株,如果还不足以说明，有些情况下还加上数字1或2来表示例如EcoR1等。（3）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后以罗马数字加以标注。来自流感嗜血菌的几种不同的限制性内切核酸酶就用Hind、Hind、Hind 等表示。117、影响限制性内切核酸酶的一些因素和实际工作中采用的方案。限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。（1）DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。（2）酶切消化的缓冲液。（3）酶切反应的温度。（4）其他因素。反应的时间

7、、消化过程中能否保持恒定的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水分散失）（5）部分消化和过消化。128、限制性内切核酸酶在生物技术中的运用。限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手术刀。（1）构建重组的DNA分子。（2）探针的制备。（3）DNA物理图谱的构建。（4）DNA甲基化的分析13二、DNA聚合酶DNA聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连接到双链DNA分子的3-OH末端，催化核苷酸的作用，形成长链的核酸分子。依据DNA聚合酶的作用和来源不同，可分为以下同种：（1）大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow酶和T4 DNA聚合酶（2）Taq DNA聚合酶（3）RNA反转录酶（4）

8、末端转移酶（5）DNA连接酶（6）碱性磷酸化酶（7）其他种类的核酸化酶类14第二节第二节基因克隆所需要的载体基因克隆所需要的载体15在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的DNA分子称为基因克隆载体。基因克隆载体必备的一些基本条件：（1）1个或多个克隆位点。（2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。（3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。（4）载体必须是安全的，不含有对受

9、体细胞有害的基因，对于细胞的生长不会产生显著的影响。16一、基因工程载体种类一、基因工程载体种类通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬菌体和质粒为基础构建的菌体和质粒为基础构建的Cosmid载载体），人工染色体载体（体），人工染色体载体（YAC、BAC、PAC、TAC）等。）等。17二、质粒载体：二、质粒载体：质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链DNA分子（或者分子（或者RNA分子），在宿主细胞体内通分子），在宿主细胞体内通常以共价闭合环状的超螺旋形式存在。常以共价闭合环状的超螺旋形式存在。基因工程中通常使用

10、基因工程中通常使用5kb以下的质粒。商业化的质以下的质粒。商业化的质粒载体一般有如下的生物学特性：粒载体一般有如下的生物学特性：（1）质粒）质粒DNA的复制的复制质粒是在宿主细胞中能够自质粒是在宿主细胞中能够自我复制的遗传单元，它是存在于宿主染色体以外的非必要组我复制的遗传单元，它是存在于宿主染色体以外的非必要组成部分，它能够随着细胞的自我复制而分配到后代中去。成部分，它能够随着细胞的自我复制而分配到后代中去。（2）质粒）质粒DNA的不亲和性的不亲和性质粒往往不能在同一宿质粒往往不能在同一宿主细胞中共存。主细胞中共存。（3）质粒的）质粒的DNA接合性性接合性性质粒往往具有促使宿主质粒往往具有促

11、使宿主细胞与受体细胞相结合，从而使遗传物质从宿主细胞向受体细胞与受体细胞相结合，从而使遗传物质从宿主细胞向受体细胞中转移。细胞中转移。182、质粒载体的构建、质粒载体的构建用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于检测、插入后能够稳定不丢失的优点。检测、插入后能够稳定不丢失的优点。质粒构建的几个原则：质粒构建的几个原则：（1）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆载体必需的。载体必需的。（2）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点，）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点，实际上在实际运用的载

12、体上具有的多克隆位点数为一实际上在实际运用的载体上具有的多克隆位点数为一个。个。（3）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括Ampr,Terr,Kanr等。等。（4）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。19四、人工染色体载体1、人工染色体载体的种类、人工染色体载体的种类构建人工染色体必须满足几个基本的条件：必须具有行使正构建人工染色体必

13、须满足几个基本的条件：必须具有行使正常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起点和端粒。点和端粒。着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和维持染色体长度所必需的元件。维持染色体长度所必需的元件。复制起点是所有生物进行复制起点是所有生物进行DNA复制所必需的。复制所必需的。202、酵母人

14、工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）3、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）4、其他类型的人工染色体P1人工染色体（P1 artificial chromosome,PAC）植物可转基因人工染色体（transformation-competent artificial chromosome,TAC）21不同类型载体的克隆外源片段能力比较不同类型载体的克隆外源片段能力比较载体类型载体类型克隆的外源片段长度克隆的外源片段长度/kb宿主细胞宿主细胞质粒载体质粒载体5大肠杆菌大肠杆菌噬菌体载体噬菌体载体15 噬菌

15、体噬菌体Cosmid载体载体1545大肠杆菌大肠杆菌Phagemid载体载体1545大肠杆菌大肠杆菌YAC2Mb酵母酵母BAC300kb细菌细菌TAC100kb细菌细菌/农杆菌农杆菌22第三节第三节植物基因组文库的构建植物基因组文库的构建23基因库基因库(library):是一组是一组DNA和和cDNA序列克隆的集合体序列克隆的集合体植物基因组文库构建必须符合以下几个基本条件植物基因组文库构建必须符合以下几个基本条件（1）文库能够覆盖整个基因组）文库能够覆盖整个基因组（2）插入的片段比较大：如插入的片段太）插入的片段比较大：如插入的片段太小，基因组文库要求的克隆数目太多，小，基因组文库要求的克

16、隆数目太多，不利于染色体的步移和组装。不利于染色体的步移和组装。（3）文库比较稳定，且容易保存和操作：）文库比较稳定，且容易保存和操作：外源的片段插入到载体以后片段本身不外源的片段插入到载体以后片段本身不会丢失，并且片段之间不会发生重组现会丢失，并且片段之间不会发生重组现象。象。24植物基因组文库构建通常包括以下几个基本步骤（1）大片段DNA克隆载体的准备（2）大分子质量的植物基因组DNA制备。（3）大片段DNA分子的部分酶切。（4）载体与外源片段的连接。（5）载体的遗传转化。（6）克隆的挑取和验证及植物基因组文库的保存。25第四节第四节基因克隆的方法基因克隆的方法26模式植物：模式植物：水稻、拟南芥、烟草水稻、拟南芥、烟草基因测序基因测序基因功能基因功能需要大量基因需要大量基因基因克隆基因克隆基因克隆方法（几十种）：归纳为基因克隆方法（几十种）：归纳为5大类大类以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为基础的基因克隆方法、以表达差异为基础的基础的基因克隆方