病毒感染实验诊断名师编辑PPT课件.ppt

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1、第四章病毒感染实验诊断 一般原则是特异敏感、快速和简一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。点，初步判断可能感染的病毒。然后根据可疑病毒的生物学特点、然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。诊断方法。1.1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产对潜伏期短，发病时尚无抗体产 生，可选择测定病毒颗粒、病毒生，可选择测定病毒颗粒、病毒 抗原或核酸。抗原或核酸。2.2.对潜伏期超过十天的感染，可对潜伏期超过十天的感染，可 检测特

2、异性的检测特异性的IgMIgM抗体来进行早抗体来进行早 期快速诊断，及区别初次和再期快速诊断，及区别初次和再 次感染。次感染。3.3.对可在体内形成持续感染或潜伏对可在体内形成持续感染或潜伏 感染的病毒，可检测急性期和恢感染的病毒，可检测急性期和恢 复期双份血清的复期双份血清的IgGIgG抗体有无抗体有无4 4倍倍 以上升高，或直接检测病毒核酸。以上升高，或直接检测病毒核酸。4.4.对原因不明或有新病毒感染时，对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同应采集标本进行病毒分离，同 时应采取双份血清以确认分离时应采取双份血清以确认分离 的病毒为病原体。的病毒为病原体。5.5.对同一症状

3、可有多种病毒引起的对同一症状可有多种病毒引起的 情况，应同时检测几种相关病毒情况，应同时检测几种相关病毒 的病毒颗粒、抗原或抗体，的病毒颗粒、抗原或抗体，6.6.对由多个型别组成的病毒可测定对由多个型别组成的病毒可测定 它们的共同抗原。它们的共同抗原。第一节标本采集与运送 一、标本的采集一、标本的采集1.1.采样时间采样时间 尽可能在发病的初期，尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。急性期或患者人院的当天进行。2.2.标本种类的选择标本种类的选择 根据临床感染根据临床感染 的症状及流行病学资料，判断可的症状及流行病学资料，判断可 能感染病毒种类，选择相应部位能感染病毒种类，选择相应部

4、位 采取标本。采取标本。常见分离病毒标本的选择常见分离病毒标本的选择 病毒病毒咽拭子咽拭子粪便粪便血液血液脑脊液脑脊液 唾液唾液 组织组织 柯萨奇柯萨奇A和和B组组+心心 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒+脑膜脑膜 腮腺炎病毒腮腺炎病毒+流感病毒流感病毒+轮状病毒轮状病毒+HAV+HIV+精液精液3 3常见标本的采集方法常见标本的采集方法(1)(1)血液：以无菌取抗凝血血液：以无菌取抗凝血10ml10ml。抗凝选用抗凝选用100n100nmlml肝素钠。肝素钠。用于分离用于分离CMVCMV、HSVHSV，、黄病，、黄病 毒、毒、EBVEBV、HIV-1HIV-1及新生儿肠及新生儿肠 道病毒。道病毒。(

5、2)(2)脑脊液：以无菌取脑脊液脑脊液：以无菌取脑脊液 1 12ml2ml，冰浴立即送检。，冰浴立即送检。在在44可存放可存放72h72h。用于分。用于分 离柯萨奇病毒、离柯萨奇病毒、ECHOECHO病毒、病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。肠道病毒、腮腺炎病毒。(3)(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部宫颈或阴道拭子：采取病灶部 位分泌物，或将拭子伸人宫颈位分泌物，或将拭子伸人宫颈 约约lcmlcm停留停留5 5秒取出，冰浴立即秒取出，冰浴立即 送检。用于分离送检。用于分离 HSVHSV、CMVCMV。(4)(4)粪便标本：取粪便标本：取2 24 4粪便加粪便加 10ml10ml运送液立即送检，用于运送

6、液立即送检，用于 分离腺病毒、肠道病毒和轮分离腺病毒、肠道病毒和轮 状病毒。状病毒。(5)(5)含漱液：用无菌生理盐水让含漱液：用无菌生理盐水让 患者含漱。用于分离流感病患者含漱。用于分离流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、毒、副流感病毒、鼻病毒、RSVRSV等。等。(6)(6)喉拭子：用压舌板避免唾液喉拭子：用压舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分离腺病毒、面。用于分离腺病毒、CMVCMV、肠道病毒、肠道病毒、HSVHSV、流感病毒等。、流感病毒等。(7)(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭尿道拭子及尿液标本：尿道拭 子伸人尿道子伸人尿道4cm4cm转动转动3

7、3次，以获次，以获 得较多的上皮细胞，用于分离得较多的上皮细胞，用于分离 CMVCMV和和HSVHSV。(8)(8)尸检标本：死亡后尽早采集各尸检标本：死亡后尽早采集各 种器官，分别使用器械和容器。种器官，分别使用器械和容器。二、标本的运送和保存病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，用于分离培养的标本要尽快送检，44下数或下数或-70-70。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)等作保护。等作保护。病毒传送培养基以病毒传送培养基以HanksHanks液为基础加液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加

8、灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素青霉素100U100Umlml和链霉素和链霉素100g100gmlml，为了抑制真菌的生长加入为了抑制真菌的生长加入2 25g5gmlml二性霉素二性霉素B B或或40g40gmlml制霉菌素。制霉菌素。第二节 病毒分离与鉴定 一、病毒的分离方法一、病毒的分离方法1.1.组织细胞培养组织细胞培养 根据细胞的来源、根据细胞的来源、特性和传代次数分为：特性和传代次数分为：(1)(1)原代细胞培养：将细胞悬液。原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单加入营养液培养。形成的单 层细胞，称之为原代细胞。层细胞，称之为原代细胞。(2)(2)二倍体细胞株：仍保

9、持二倍体二倍体细胞株：仍保持二倍体 特性。寿命一般为特性。寿命一般为40405050代，代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒如人胚肺细胞。广泛用于病毒 分离和疫苗制备。分离和疫苗制备。(3)(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞常用的有人宫颈癌细胞(Hela)(Hela)、人喉上皮癌细胞人喉上皮癌细胞(Hep-2)(Hep-2)。2 2鸡胚接种鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘鸡胚是用于分离粘 病毒科、疱疹病毒、痘类病毒病毒科、疱疹病毒、痘类病毒 的较为理想的材料。的较为理想的材料。3 3动物接种动物接种 动物对病毒的敏

10、感动物对病毒的敏感 性是不同的，选择合适动物十性是不同的，选择合适动物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。豚鼠、猴等常用于分离病毒。常用于病毒分离的细胞常用于病毒分离的细胞 细胞种类细胞种类可分离的病毒可分离的病毒 原代细胞原代细胞 非洲绿猴肾细胞非洲绿猴肾细胞 人单核细胞人单核细胞 人胚肾、肺细胞人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒腮腺炎病毒、腺、腺病毒病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、组、RS

11、V 二倍体细胞株二倍体细胞株 人胚肺成纤维细胞株人胚肺成纤维细胞株 WI-38、MRC5 CMV、VZV、鼻、鼻病毒病毒腮腺炎病毒腮腺炎病毒、腺、腺病毒病毒 传代细胞系传代细胞系 Hela Hep-2 Vero 柯萨奇柯萨奇A、B组、组、RSV腺腺病毒、病毒、RSVHSV、RSV、风疹病毒、风疹病毒、轮状、轮状病毒、麻疹病毒病毒、麻疹病毒三、病毒的鉴定 必须通过全面了解其特性才能必须通过全面了解其特性才能得到鉴定。得到鉴定。1.1.根据临床特点，流行病学资根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认毒的一些特性，有助于确认 病毒的种类。病

12、毒的种类。2.2.动物感染范围及特点动物感染范围及特点 病毒感病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。染动物的范围、发病的潜伏期。3.3.细胞培养特点。细胞培养特点。综合上述资料作出鉴定。综合上述资料作出鉴定。病毒鉴定的方法1.1.细胞培养的结果观察细胞培养的结果观察 病毒增殖后导致细胞发生病毒增殖后导致细胞发生:细胞病细胞病 变效应变效应(CPE)(CPE)。细胞肿大，变圆堆积。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；不出现细胞病

13、变现象。不出现细胞病变现象。细胞培养液细胞培养液pHpH的变化。的变化。2.2.中和试验中和试验病毒与特异性抗体进行免疫反应，病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。如常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒，型病毒，用于病毒的分型诊断最具敏感和用于病毒的分型诊断最具敏感和准确性。也可用于检查患者病后准确

14、性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。增加情况。3.3.空斑或蚀斑形成试验空斑或蚀斑形成试验 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包起死亡的细胞区域，周围被活细胞包 围。一般而言，一个空斑是由一个感染围。一般而言，一个空斑是由一个感染 性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形态和大小不同。可进行病引起的空斑形态和大小不同。可进行病 毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可 进行病毒的鉴定。进行病毒的鉴定。4.4.干

15、扰现象干扰现象 某些病毒间存在着干扰现象，某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰如某些型别的鼻病毒能干扰 以后进入的副流感病毒的增以后进入的副流感病毒的增 殖，从而阻抑后者的红细胞殖，从而阻抑后者的红细胞 吸附作用。吸附作用。5.5.红细胞吸附及吸附抑制试验红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原但在细胞表面含有病毒某些抗原成分成分(血凝素血凝素)，能吸附鸡、豚鼠，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。或猴红细胞。可作为初步鉴定。如果在培养瓶可作为初步鉴定。如果在培养

16、瓶中加入相应的血凝素抗血清后，中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。病毒鉴定的依据。4 4血凝试验及血凝抑制试验血凝试验及血凝抑制试验 某些病毒可与一定种类的哺乳某些病毒可与一定种类的哺乳 动物或禽类的红细胞产生血凝动物或禽类的红细胞产生血凝 现象。加入相应的血凝素抗体现象。加入相应的血凝素抗体 可抑制血凝现象的发生，是为可抑制血凝现象的发生，是为 血凝抑制试验。可作为病毒型血凝抑制试验。可作为病毒型 别确定的依据。别确定的依据。5病毒的大小及形态 可用电子显微镜观察病毒的可用电子显微镜观察病毒的 大小及形态。大小及形态。6 6核酸类型鉴别及序列测定核酸类型鉴别及序列测定 利用利用5 5溴溴-2-2-脱氧尿苷脱氧尿苷(BUDR)(BUDR)抑抑 制制DNADNA复制的特性，在细胞培养液中复制的特性，在细胞培养液中 加入该物质，可抑制加入该物质，可抑制DNADNA病毒的复制病毒的复制 和增殖，抑制细胞病变的出现，但对和增殖，抑制细胞病变的出现，但对 RNARNA病毒无抑制