《食品分析》教案——第八章 蛋白质和氨基酸的测定.docx

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1、食品分析教案（第13次课2学时）一、授课题目第八章蛋白质和氨基酸的测定第一节概述第二节蛋白质的定量测定1二、教学目的和要求学习本章内容，要求学生了解蛋白质、蛋白质系数的概念，凯氏定氮法原理和方法；掌握凯氏定氮装置的组件和安装、使用知识。熟练地掌握常量、微量凯氏定氮法的操作技能。三、教学重点和难点重点：凯氏定氮法原理、分步、测定方法。难点：微量凯氏定氮仪的使用四、主要参考资料1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，20042、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，20063、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，20074、曲祖乙

2、、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，20061、学时分配：2学时2、辅导手段：自习答疑3、教学办法：讲授4、板书设计：（见上页）5、教学内容:第八章蛋白质和氨基酸的测定第一节概述一、蛋白质的生理功用及在食品中的作用1、蛋白质是生命的物质基础,是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及运转都与蛋白质有关。2、蛋白质是人体重要的营养物质。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，人体11%13%总热量来自蛋白质。3、蛋白质是食品的最重要质量指标

3、,其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。二、蛋白质系数蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万-数百万，分子的长轴则长数nm-100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、0、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe.等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉

4、中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%,兔肉为21%,鸡肉为20%,牛乳为3.5%黄鱼为17.0%,带鱼为18.0船大豆为40%,稻米为8.5乐面粉为9.9乐菠菜为2.4乐黄瓜为1.0%,桃为0.8%,柑橘为0.9%,苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%,即份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数J不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，养麦，青豆，鸡蛋等为6.25,花生为5.46,大米为5.95,大豆及其制品为5.71,小麦粉为5.70,牛乳及其制品为6.38。三、

5、氨基酸氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，目前分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种。在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缀氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。以研究食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的组成为基础，从而提高蛋白质的生理效价的食品开发研究成为一个热门话题。四、蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋

6、白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法一一最常用的，国内外应用普遍。双缩胭反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪氨基酸总量一一酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量一一色谱技术。有多种氨基酸分析仪。第二节蛋白质的定量测定一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%,兔肉21%,肉20乐乳3.5%鱼18.0%豆40%,面粉9.9%,菠菜2.4乐瓜1.0%,苹果1.4%测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。N16%一些蛋白质的含氮量一

7、般为15%17.6%,有的上下浮动=NX6.25=蛋白质含量一、凯氏定氮法过程：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物(如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、吓咻和含氮的色素)，故此法的结果称为粗蛋白质含量。适用范围：凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。方法：由KieldhI于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。微量凯氏定氮法样品

8、质量及试剂用量较少,且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。主要学习常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法的原理、测定方法及操作技能，要求同学们能组装仪器，能独立进行实验。(一)常量凯氏定氮法1、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸钱。然后加碱蒸储，使氨蒸出。用LBO3吸收后再以标准HCI溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出

9、蛋白质的含量。也可以用过量的标准IhSOi或标准HCI溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸储、吸收与滴定（1）消化总反应式：2NH2（CH）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O98%浓硫酸浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。H2SO4C=2SO2+2H2O+CO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸核留在酸性溶液中。H2SO4+2NH3=（NH4）2SO4加硫酸钾增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点34

10、0,加入硫酸钾之后可以提高至400C以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾（沸点：1689C）O加硫酸铜催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸僧时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。（2）蒸储消化液+40%氢氧化钠加热蒸储，放出氨气。2NaOH（NH4）2SO4=2NH3I+Na2SO4+2H2O（3）吸收与滴定用钱硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红一澳甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。指示剂红色-绿色红色（酸）吸收（碱）滴定（酸）用过量的H2SOi或HCl标准溶液吸

11、收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。2、适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定3、操作方法：158页（1）样品消化准确称取均匀的固体样品0.53g,或半固体样品25g,或吸取溶液样品1525ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中（勿粘附在瓶壁上）。加入0.5Ig硫酸铜、IOg硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后,加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h

12、,冷却至室温。（2）蒸储、吸收IO加M凯氏定氨消化、蒸饰装置1一水力剂Ir留2一水龙头3倒筲的I摩耸4-凯氏坛械5、7电炉8燃愉烧械6、9饮文5WIO进样汕斗11-冷凝管12指枚肌按图装好蒸储装置冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g/L硼酸溶液及混合指示剂2-3滴）。在凯氏烧瓶内加入IoOnII蒸储水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml400gL氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用宜火加热蒸储30min,将蒸储装置出口离开液面继续蒸储Imin,用蒸储水淋洗尖端后停止蒸馆。“以奈氏试剂”检查氨是否全部蒸完，奈氏试剂（NeSSIer试剂，K2（Hgl4）

13、检验NH；离子，遇筱根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制方法1、3.5gKl+1.3gHgCI2溶于70毫升水。加30毫升4molL氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方法2、溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。（3）滴定将接受瓶内的硼酸液用0.ImolZL盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。4结果计算：158页注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25也可查表。5、说明：所用试剂溶液应用无氨蒸储水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附

14、在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2-3ml后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品.如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸

15、、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸储装置不能漏气。蒸播前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜在7090时发黑。硼酸吸收液的温度不应超过40。C,否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。蒸储完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源.否则可能造成吸收液倒吸。强混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。（二）、微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸储装置见159页图10-2o4、操作方法（结合实验书来讲）（1）消化：要将消化完全后的消化液定容到100mL容量瓶。（2）装置的安装：与常量法不同，将在技能教学中讲述。（3）蒸储、吸收：与常量法不同的是取样品定容液IOmL,1/10吸收液硼酸IOmL用水蒸汽蒸出氨注意问题：在