血红蛋白的凝胶过滤.ppt

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1、血红蛋白的凝胶过滤血红蛋白的凝胶过滤凝胶层析技术及原理凝胶凝胶:是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体的网状结构的网状结构.交联葡聚糖(sephadex)琼脂糖凝胶(sepharose)聚丙烯酰胺凝胶(BIO-Gel P)硅胶 (Silicon dioxide or Silica gel)分子筛凝胶是一种分子筛凝胶是一种不带电不带电的具有三的具有三维空间的维空间的多孔网状结构多孔网状结构的物质，每的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，匀一致，小分子可以进入凝胶网孔小分子可以进入凝胶网孔，而而大分子则排阻于颗粒

2、之外大分子则排阻于颗粒之外。凝胶层析凝胶层析(Gel chromatography):凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分

3、离（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav 值的大小与凝胶床的总体积（值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体）、外水体积（积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关）有关，即：，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，Vt 和和 Vo 都是恒都是恒定值，而定值，而 Ve 值却是随着分离物分子量的值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，变化而变化的。分离物分子量大，Kav 值值小；反之，则小；反之，则 Kav 值增大。因此，在同一值增大。因此，在同一凝胶

4、柱上分离分子量不同的物质时，由于凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生流动相的作用，这些分离物质将发生排阻排阻和扩散和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同

5、的物质相管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开互分离开常用的色谱分离方法一.按两相所处的状态分类 气相色谱法:气固色谱法,气液色谱法 液相色谱法:液固色谱法,液液色谱法二.按固定相的几何形式分类 柱色谱法 纸色谱法 薄层色谱法凝胶过滤技术特点 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的保持有

6、独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。的分离效果。凝胶层析的应用 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。测定高分子物质的分子量 高分子溶液的浓缩凝胶层析应用1.生物大分子的纯化生物大分子的纯化 凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化性等优点，使

7、得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。无疑是一种合适的方法。2.分子量测定分子量测定在一定的范围内，各个组分的在一定的范围内，各个组分的Kav以及以及Ve与其分子量的对数成线性关系。与其分子量的对数成线性关系。Kavb lg MWc Veb lg MWc 由此通过对已知分子量的标准物质进行由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出洗脱，作出Ve或或Kav对分子量对数的标对分子量对数的标

8、准曲线，然后在相同的条件下测定未知准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的物的Ve或或Kav，通过标准曲线即可求出，通过标准曲线即可求出其分子量。其分子量。3.脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质 利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是一般常用的是Sephadex G-25，另，另外还有外还有Bio-Gel P-6 等排阻

9、极限较小等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵成品出售，使用方便，但价格较贵。4.溶液的浓缩 利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。5.蛋白质的复性蛋白质的复性 为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间

10、相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。影响分离效果的因素1.基质的颗粒大小、均匀度基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速洗脱液的流速4.样品的种类等，样品的种类等，5.缓冲液的缓冲液的

11、pH6.而最直接的影响是而最直接的影响是 Kav 值的差异性，值的差异性，Kav 值差异性大，分离效果好；值差异性大，分离效果好；Kav 值值差异性小，则分离效果很差，或根本不能差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开分开。影响凝胶过滤的因素 层析柱的选择 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm 加样量 加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。凝胶柱的鉴定 凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡 洗脱速

12、度 一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长本实验的原理 本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。实验主要步骤凝胶溶胀装柱制

13、备血红蛋白样品平衡（20min）上样和缓冲液洗脱形成层析柱还原层装柱注意事项 1.装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。3.进行实验时，注意与目标物分子量相似的尽量少。4.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。操作步骤1 1.装柱装柱:检查上下柱帽是否通畅检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽将接线短的柱帽接在层析柱的下端接在层析柱的下端.加入加入1/8柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲液液,搅拌小烧杯里的凝胶搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层并连续

14、的装入层析柱中析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于使沉积后的凝胶高度不低于12cm,接上上端的柱帽接上上端的柱帽,将其连线插入三将其连线插入三角瓶里磷酸盐缓冲液中角瓶里磷酸盐缓冲液中,平衡平衡20分钟分钟.操作步骤2 2.上样前的准备上样前的准备 调节恒流泵的流速为调节恒流泵的流速为610滴滴/分钟分钟,并将并将其进水口与层析柱的下端接线相接其进水口与层析柱的下端接线相接.撤去柱上端的柱帽撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一放入与柱内径大小一致的滤纸片一块致的滤纸片一块,检查胶面是否平整检查胶面是否平整,层析层析柱是否均匀柱是否均匀.然后将胶面上的缓冲液用排然后将胶面上的缓冲液用排气键放至与胶面相

15、齐气键放至与胶面相齐,关上恒流泵关上恒流泵.切忌干切忌干胶胶!步骤3 A.上样上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启于滤纸面上。开启恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。B.上上1ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液,开启泵开启泵,至液面与胶至液面与胶面相齐。关泵。面相齐。关泵。C.上上0.5ml血红蛋白样，开泵，至液面与血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。胶面相齐，关泵。D.同同B操作。操作。E.上上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。钾。凝胶过滤层析中,小分子物质能进入填料内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。Thanks a lot