血红蛋白的提取与分离.ppt

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1、思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质

2、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构思考思考4 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取，人的红细胞无的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。富便于提取血红蛋白。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝

3、胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的

4、蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

5、促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液）的对溶液的（的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值3、缓冲溶

6、液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白环境，

7、保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性）1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用不同，在电场中受到的作用力力大小、方向、阻力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在不同，导致不同蛋白质在电场中的电场中的运动方向运动方向和和运动速度运动速度不同不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考思考：

8、蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可解离的基团会带上电荷，蛋白质可解离的基团会带上电荷电泳：电泳：影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定运动方向运动方向电场电场作用力作用力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小1、原理：、原理：聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状

9、结构的凝胶聚合交联成三维网状结构的凝胶测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的的量大大

10、超过了蛋白质分子原有电荷量。量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小电泳检测电泳检测PCR结果结果二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机

11、盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（每个肽链环绕（），此），此基团可携带（基团可

12、携带（）。）。血红蛋白因含有（血红蛋白因含有（）而呈红色。本课）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为质量分数为0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）重复重复4、5步骤（步骤（）次，直至上清）次，直至上清液中已没有（液中已没有（）

13、，表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。涤次数过少。五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水三三黄色黄色(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞溶解细胞膜膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶

14、液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色用滤纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透

15、明液体液体。取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是小时，目的是（）或用）或用于更换样品中的（于更换样品中的（）。透析袋一）。透析袋一般用般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析12.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.6

16、1.6厘米的玻璃厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；中间打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在），在0.5ml0.5ml的（的（）头部）头部切下（切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在（剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（上，用（）的尼龙纱将橡皮塞）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。）包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做（、色谱柱下端用移液头部做（），），