荧光原位杂交更新.ppt

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1、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 简简 介介n原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）Gall和Pardue 1969年建立。用标记的DNA或RNA作为探针，对组织细胞内的核酸或有丝分裂中期的染色体进行原位检测和观察。n最初的探针大多以同位素3H、32P等标记，但因同位素标记探针对人体有放射损害、实验周期长、放射自显影的分辨率有限、环境污染等缺点，给研究及实际应用带来了诸多不便。n荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISHFISH）利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定

2、位和定量分析nFISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科分子细胞遗传学。杂交流程杂交流程a.a.两要素：两要素：探针和靶序列b.b.标记探针标记探针 直接标记和间接标记c.c.变性变性 探针和靶序列成为单链探针和靶序列成为单链d.d.混合杂交混合杂交e.e.间接标记的探针需连接荧光基团的步骤荧光标记的荧光标记的DNADNA探针探针 （200-500bp200-500bp）F I S H 荧光原位杂交特点荧光原位杂交特点n与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：经济安全，快速方便；敏感性高

3、，特异性强，背景低；宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色；使用G带玻片可作出回顾性分析；n缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。n基因特异探针靶向每条染色体只有一个拷贝的DNA序列。n主要用于间期或中期染色体中识别染色体易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合征、标记染色体和染色体扩增等，可检测基因的扩增和重排。常用探针类型常用探针类型 基因特异探针基因特异探针常用探针类型常用探针类型 重复序列探针重复序列探针n重复序列探针的结合位点是基因组中多拷贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端粒探针）所在的染色体区域。n着丝粒常常

4、是A-T丰富区，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚端粒缺失和标记染色体。n2121三体三体FISHFISH 常用探针类型常用探针类型 WCP探针探针n全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中观察到的复杂染色体重排。nM-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器(CCD)照相机和

5、Fourier变换光谱法相结合，同步曝光成像。n这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室中开展。WCP探针（探针（SKY）技术结合技术结合产前产前BoBSnBACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150-170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、不受DNA质量影响、更高的覆盖率。n将BAC DNA探针耦联至Luminex xMAP荧光编码的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合，BACs-on-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH实验。n高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测13，18，21，X，Y染色体

6、拷贝数目的变化外，还可检测9种常见的微缺失综合征。技术结合技术结合 FQ-PCRn来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链反应 和FISH的结合；n对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物对染色体特异性高度多态性DNA短重复序列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增n检测“有”或“无”和数目异常；位置异常无法判断，如平衡性染色体重排。技术技术13,18,21三体三体微缺失微缺失解释容易解释容易成本成本平台费用平台费用产前产前 BoBs+核型分析核型分析+-+FISH+-+QF-PCR+-+-几种技术平台比较几种技术平台比较 细胞遗传学技术的比较细胞遗传学技术

7、的比较 FISH相关项目相关项目n羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养和培养）n血细胞荧光原位杂交分析n其他各类细胞荧光原位杂交分析nSRY等单基因分析n胚胎染色体病诊断（PGD）结合技术相关检测项目结合技术相关检测项目n染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、BoBs）n产前单基因病诊断nSNP Array 检测n某些代谢病的产前诊断 项目意义项目意义n1.快速且准确进行检测快速且准确进行检测 较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。n 2.弥补核型检测失败无

8、报告的问题弥补核型检测失败无报告的问题 FISH对于样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等各种原因导致的核型分析失败均可针对性的给予弥补，解决占染色体数目异常的80-90%问题。n3.FISH与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。n4.BoBs可检测9种常见的微缺失综合征，拓宽了检测范围。工作基础工作基础n探针 商品化探针n原位杂交仪nLuminex xMAP液相芯片检测平台 工作基础工作基础n工作人员 1）项目负责人 刘红卫，男，妇产科实验室技术负责人，毕业于四川大学生物工程系遗传学专业，临床遗传优生专业副主任医师，丰富的技术操作和管理能力。2）项目组成员 赵少志，男，检验师，四川大学华西医院医学遗传学硕士，中国遗传医学中心、医学遗传学国家培训中心学员。