蛋白质表达1.ppt

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1、 mRNA的生物合成的生物合成 蛋白质生物合成蛋白质生物合成 原核生物表达系统原核生物表达系统 真核生物表达系统真核生物表达系统 蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 蛋白质生物合成的基本原理蛋白质生物合成的基本原理参与蛋白质生物合成的物质包括参与蛋白质生物合成的物质包括:1、三种、三种RNA mRNA（messenger RNA）rRNA（ribosomal RNA）tRNA（transfer RNA）2、20种氨基酸作为原料种氨基酸作为原料3、酶及众多蛋白因子、酶及众多蛋白因子4、ATP、GTP、无机离子等、无机离子等mRNA的生物合成的生物合成(转录转录)目的基因目的基因 RNA聚合酶聚合酶

2、 启动子启动子 转录终止信号转录终止信号 转录因子等等转录因子等等 启动子是启动子是DNA分子可以与分子可以与RNA取聚合酶特异结合的取聚合酶特异结合的部位部位,也就是转录开始的部位。也就是转录开始的部位。某个基因是否表达决某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。定于特定的启动子的起始转录。以开始转录生成以开始转录生成RNA 5端端 第一个核苷酸的位置为第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。转录的起始点不是翻译起始点。转录的起始点不是翻译起始点。启动子启动子原核生物启动子原核生物启动子5-TTGACG-TATAA-起始

3、位点起始位点-3 -35区区 -10区区 +1（A、G）Pribnow框框真核生物启动子真核生物启动子5-GC-CAAT-TATA-起始位点起始位点-3 -80-110区区 -75区区 -25区区 +1（A、G）Hogness框框-35区与区与-10区之间的距离大约是区之间的距离大约是1619bp，小于，小于15bp或大于或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动都会降低启动子的活性。强启动子子-10和和-35区之间的间隔为区之间的间隔为171 bp，增加或减少，增加或减少都能明显影响启动子强度。都能明显影响启动子强度。-10区与区与-35区的最佳间距区的最佳间距在克隆基因上游设置调节型强启动

4、子是一个高效的蛋白质表达在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。系统最基本的条件。不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的，弱的则相反。则相反。外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。解决的办法：解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细

5、胞生长引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。调节型强启动子调节型强启动子转录终止信号即转录终止信号即终止子终止子，其作用是使其作用是使RNA聚合酶聚合酶在在DNA模板的特异位点模板的特异位点终止终止RNA的合成。的合成。转录终止信号转录终止信号(DNA)3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5(RNA)5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了

6、规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。破坏终止子的功能。茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 使使RNA聚合酶变构，转录停止；聚合酶变构，转录停止；使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。产物释放。5pppG5335蛋白质的生物合成（翻译）蛋白质的生物合成（翻译）mRNA起始翻译受下列因素影响起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点 AUG前后的核酸序列前后的核酸序列SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3-11bp

7、）。SD序列与16s rRNA3末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。mRNA5-UAAGGAGGU-AUG 16S rRNA3 -AUUCCUCCA-mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点大肠杆菌大肠杆菌mRNAs的的SD顺序与顺序与16SrRNA的的3-端的互补性端的互补性DB 序列序列 5-AUGAAUCACAAAGUG-3 DB 序列（序列（downstream box）位于起始密码下游，）位于起始密码下游，16S rRNA的的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响碱基互补。这个

8、序列也影响mRNA的起始翻译。的起始翻译。真核生物无真核生物无SD序列，但是有一个序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响序列，这个序列影响真核真核mRNA的起始翻译。这个序列的起始翻译。这个序列-3位的位的A最重要，而且在最重要，而且在+4位最好是嘌呤，位最好是嘌呤，G是最优的碱基。是最优的碱基。AUG前后的核酸序列前后的核酸序列G C C A C C A U G G-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 遗传密码与遗传密码与tRNA 除了极个别情况除了极个别情况,遗传密遗传密码在所有的有机体内是码在所有的有机体内是相同的相同的,但是不同的有机但是不同的有机体内不同密码子的使

9、用体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同程度不同。而这种不同是由于是由于tRNA在不同的机在不同的机体内的丰度不同。体内的丰度不同。N端端fMet或或Met的切除的切除 二硫键的形成二硫键的形成 特定氨基酸的修饰特定氨基酸的修饰 切除新生肽链中非功能片段切除新生肽链中非功能片段 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 糖基化，磷酸化等等糖基化，磷酸化等等蛋白质前体的加工蛋白质前体的加工不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白位于细胞内的特异区域，或者分泌出

10、细胞。分泌性蛋白都有一段都有一段信号肽信号肽，即在蛋白质合成过程中，即在蛋白质合成过程中N端有一端有一1536个氨基酸残基的肽段个氨基酸残基的肽段-信号肽，它能引导蛋白质的肽链信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。蛋白质的分泌蛋白质的分泌一些信号肽的一级结构一些信号肽的一级结构蛋白的分泌（一）蛋白的分泌（一）蛋白的分泌（二）蛋白的分泌（二）蛋白的糖基化蛋白的糖基化革兰氏阳性菌蛋白的分泌革兰氏阳性菌蛋白的分泌革兰

11、氏阴性菌蛋白的分泌革兰氏阴性菌蛋白的分泌 多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助下辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。然构象的具有

12、生物学活性的蛋白质。伴侣蛋白伴侣蛋白理想的表达载体质粒包括：理想的表达载体质粒包括：一个具有一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点一个调节型的强启动子一个调节型的强启动子一个选择性标记一个选择性标记一个复制起点一个复制起点一个有助于蛋白质的稳定一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签纯化并可去除的融合蛋白标签一个转录终止信号一个转录终止信号一个分泌信号肽（分泌型）一个分泌信号肽（分泌型）表达载体质粒表达载体质粒融合蛋白融合蛋白 融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融

13、合蛋白的作用：起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用：提高外源蛋白在表达系统中的稳定性提高外源蛋白在表达系统中的稳定性增加外源蛋白在表达系统中的表达量增加外源蛋白在表达系统中的表达量增加目的蛋白的溶解性增加目的蛋白的溶解性作为抗原的标记蛋白作为抗原的标记蛋白易于外源蛋白的纯化易于外源蛋白的纯化融合蛋白作为抗原的标记蛋白融合蛋白作为抗原的标记蛋白C-myc 标记蛋白V5 标记蛋白MBP麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白Amylose树脂树脂MBPFactor Xa 蛋白酶切割位点蛋白酶切割位点10 mM 麦芽糖麦芽糖目的蛋白目的蛋白融合蛋白易于外源蛋白的纯化融合蛋白易于外源蛋白的纯化融合蛋白的纯化融合

14、蛋白的纯化非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化原核生物表达系统原核生物表达系统原核生物表达系统原核生物表达系统:大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用的载体可供选择应用易于进行遗传操作和高效表达易于进行遗传操作和高效表达操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低生长迅速生长迅速,培养代谢易于控制培养代谢易于控制,成本相对低等等成本相对低等等大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不

15、宜表缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白达真核生物的蛋白缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构构,常形成不溶性包涵体常形成不溶性包涵体(inclusion body)表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热大肠杆菌表达体系的转录调控大肠杆菌表达体系的转录调控 P：启动子：启动子 O：操纵子：操纵子 I：调节基因：调节基因 I CAP调控序列调控序列 结构基因结构基因乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac oper

16、on）：）：大肠杆菌的基因多数以大肠杆菌的基因多数以操纵元操纵元的形式组成基因表达调控的单元，的形式组成基因表达调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 y：通透酶：通透酶 a：转乙酰基酶：转乙酰基酶 乳糖乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的：而实现的：大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏操纵元处于阻遏状态。状态。i基因在自身的启动子基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍结合，阻碍RNA聚合酶与启动子聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。的结合，阻止基因的转录起始。R的阻遏作用不是绝对的，的阻遏作用不是绝对的，R与与O偶尔解离，使细胞中还有偶尔解离，使细胞中还有极低水平的极低水平的-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏当