蛋白质电泳技术.ppt

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1、电泳技术电泳技术一、基本理论一、基本理论 1.常用公式和术语常用公式和术语o E=U/L电场强度电场强度(V/cm)=电压电压(V)/电极间距电极间距(cm)*相对迁移率相对迁移率 mR=蛋白质迁移距离蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离示踪染料迁移距离o ep=v/E=l/(tE)=lL/(tU)=q/(6r)(cm2/(s*V)F=qE=F=6rvl：蛋白质迁移距离蛋白质迁移距离o 电泳速度电泳速度v=epE=epJ/K o 分离度分离度DULDULReff2424影响电泳的环境因素影响电泳的环境因素电泳速度电泳速度 v=epE=E/(C)o C:6or 4 E pH:pI(4-7),缓冲溶液

2、缓冲溶液pH(8-9.5),向？极泳动向？极泳动 离子强度离子强度I:0.02-0.2 电渗电渗 温度：焦耳热温度：焦耳热 介质：孔径、制胶重复性等介质：孔径、制胶重复性等2.分类分类 按原理按原理:o 区带电泳区带电泳,(移界电泳移界电泳),稳态电泳稳态电泳,显微电泳显微电泳3.电泳仪及附属设备电泳仪及附属设备 提供稳定直流电源的装置提供稳定直流电源的装置o 电压、电流、电功率稳定电压、电流、电功率稳定o 脉冲式脉冲式 电压电压o 常压电泳仪常压电泳仪(600V):净电荷和净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳o 高压电泳仪高压电泳仪(3kV):载体两性电解质等电聚焦电泳载体两

3、性电解质等电聚焦电泳和和DNA测序测序o 超高压电泳超高压电泳(30-50kV):毛细管电泳毛细管电泳 电泳槽电泳槽o 板状电泳槽板状电泳槽 水平板水平板 垂直板垂直板o 管状电泳槽管状电泳槽*自由界面电泳槽自由界面电泳槽DYCP-33A型型 琼脂糖水平电泳仪琼脂糖水平电泳仪(槽槽)(中号中号)DYCZ-22B型型 单垂直电泳仪单垂直电泳仪(槽槽)（大号）（大号）4.电泳的支持介质电泳的支持介质 特性（要求）特性（要求）o 物理化学性质稳定物理化学性质稳定o 化学惰性化学惰性o 均匀均匀 种类种类分离原理分离原理特性特性物质物质薄膜类薄膜类 电荷密度电荷密度化学惰性化学惰性对流扩散小对流扩散小

4、纸、醋酸纤维素薄膜、纸、醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜凝胶类凝胶类 电荷密度电荷密度分子大小分子大小同上同上+多孔性分多孔性分子筛效应子筛效应（淀粉）、（淀粉）、聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、新型凝胶介质新型凝胶介质5.检测检测-染色方法染色方法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝：常用：常用 荧光染料：灵敏荧光染料：灵敏 硝酸银：灵敏硝酸银：灵敏 酶活性酶活性 免疫学：专一免疫学：专一 特殊蛋白质特殊蛋白质o 糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白 三苯基甲烷衍生物，三苯基甲烷衍生物，-SO3-蛋白质的碱性蛋白质的碱性基团基团染料染料-蛋白质复合物。蛋白

5、质复合物。o R型型o G型二甲花青亮蓝型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍甲基取代的三苯基甲烷衍生物生物 染色染色o 固定蛋白质固定蛋白质-染色染色-脱色脱色o 同时固定和染色同时固定和染色-脱色脱色o 脱色脱色 30%甲醇的甲醇的10%乙酸溶液等乙酸溶液等二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis 支持介质：琼脂糖支持介质：琼脂糖 结构：结构：1,3连接的连接的-D半乳糖和半乳糖和1,4连接的连接的3,6脱脱水水-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构以分子内和分子间氢键形成交

6、联结构 特点：大孔胶，适于核酸、线性特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA,RNA分分离分析离分析 分离原理：分离原理：0.2-50kb 操作形式：水平电泳、免疫操作形式：水平电泳、免疫 电泳、平板等电聚焦电泳、平板等电聚焦AgaroseD-galactose3,6-anhydroL-galactose 性能指标性能指标o 电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用脱水收缩作用o 纯度：硫酸根含量少，纯度高纯度：硫酸根含量少，纯度高 应用：核酸研究应用：核酸研究,不同浓度凝胶分离不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA 检测：荧光染料溴乙啶，电泳

7、后染色检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色 操作过程：操作过程：o 见见Agarose Gel Electrophoresis.ppt三、醋酸纤维素薄膜三、醋酸纤维素薄膜cellulose acetate film 纤维素纤维素-乙酰化乙酰化 特点特点o 定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色o 较快速：电渗小较快速：电渗小o 灵敏度高，样品用量少：灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质微克蛋白质o 薄膜可保存薄膜可保存o 操作简单快速价廉操作简单快速价廉 应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等脱氢酶、多肽等四、聚丙烯酰

8、胺凝胶电泳四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 以以polyacrylamide gel为分离介质为分离介质 分离原理：电荷密度分离原理：电荷密度+分子筛分子筛 特点特点 应用领域应用领域 操作形式操作形式o(圆盘电泳圆盘电泳)o 垂直板电泳垂直板电泳o 水平板电泳水平板电泳1.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamide gel,PAG 聚合聚合o 化学聚合化学聚合o 光聚合光聚合 总浓度与交联度总浓度与交联度单体单体交联剂交联剂催化剂催化剂丙烯酰胺丙烯酰胺 +N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺 PAGAcrBis加速剂加速剂过硫铵过硫铵(AP)-化学聚合化学聚合 or核黄素核

9、黄素VB12 光聚合光聚合N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED反应反应影响因素影响因素产物特点产物特点应用应用浓度、比例、浓度、比例、pH、温、温度、含氧、杂质等度、含氧、杂质等孔径较小孔径较小分离胶分离胶光照条件光照条件孔径较大孔径较大浓缩胶浓缩胶总浓度与交联度的影响总浓度与交联度的影响 凝胶浓度凝胶浓度 T=(a+b)/m 100%(g/mL)交联度交联度 C=b/(a+b)100%o a=mAcr;b=mBis;m=V a/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等凝胶性状、孔径、分子筛效应等o C=6.5-0.3T 浓度筛选：标准凝胶浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶或梯度胶凝

10、胶孔径凝胶孔径 CT nm1515256.62.41.92.88.02.31.62.43.610.01.91.42.03.012.01.7915.01.47蛋白质蛋白质相对分子量相对分子量适用适用凝胶浓度凝胶浓度蛋白质蛋白质相对分子量相对分子量适用适用凝胶浓度凝胶浓度50万万2-54-10万万10-152.连续聚丙烯酰胺凝胶电泳连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959)凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变不变 分离原理：样品电荷分离原理：样品电荷 特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高率不高 适用：简单样品适用：简单样品3.不

11、连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 含义：不同胶孔径、不同缓冲液含义：不同胶孔径、不同缓冲液 分离原理：电荷效应分离原理：电荷效应+分子筛效应分子筛效应 特点：样品成分浓缩特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；分离，分辨率高；操作复杂操作复杂 适用：广泛应用的主要电泳技术适用：广泛应用的主要电泳技术 3种物理效应种物理效应o 样品浓缩；分子筛效应；电荷效应样品浓缩；分子筛效应；电荷效应 不连续性不连续性o 凝胶浓度：浓缩胶凝胶浓度：浓缩胶-分离胶分离胶o 缓冲液离子成分缓冲液离子成分o 缓冲液缓冲液pHo 电位梯度电位梯度 制胶制胶分分离离胶胶 样品胶样品胶浓缩胶浓缩胶抽气抽气浓缩胶

12、储液浓缩胶储液:2(10%Arc+2.5%Bis)1.0mol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液pH6.8:140%蔗糖蔗糖:4TEMED:0.0054mg/100mLVB120.001水封水封静置静置蒸馏水蒸馏水:4.930%凝胶储液凝胶储液:2.5(29.1%Arc+0.9Bis%)1.5mol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液,pH8.9:2.510%Ap:0.05TEMED:0.006水封水封静置静置抽气抽气25mmol/L Tris+192mmol/L Gly缓冲液缓冲液pH8.3-+4.SDS-PAGE十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离原理分离

13、原理:分子筛分子筛-分子相对分子质量分子相对分子质量o 蛋白质蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电复合物呈棒状且大量带电(-),消消除样品蛋白质分子间电荷差异除样品蛋白质分子间电荷差异 应用：应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定蛋白质纯度检测和相对分子量测定 操作形式：多用垂直管或垂直板，不连操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶续系统，或梯度胶SDS-PAGE 操作特点操作特点o 样品样品:o 制胶：制胶：o 缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDSo 等等 分子量的确定分子量的确定o 染色染色 考马斯亮蓝考马斯亮蓝-蛋白质吸附量蛋白质吸附量-近似近似B

14、eer定律定律 其他染色其他染色o 计算标准蛋白质计算标准蛋白质mR，作，作lgMr-mR标准曲线标准曲线o 待测蛋白待测蛋白mR-Mr同时测定同时测定5.梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳 分离胶浓度为线性或指数梯度分离胶浓度为线性或指数梯度 分离原理：蛋白质分子大小分离原理：蛋白质分子大小 T 4-30%,Mr 5万万-200万，分辨较小万，分辨较小Mr差异差异 可不与可不与SDS反应，与反应，与SDS-PAGE互补互补 常加入常加入SDS 制胶：梯度混合器制胶：梯度混合器五、等电聚焦电泳五、等电聚焦电泳isoelectric focusing IEF 分离原理：利用分离原理：利用pH梯度的介质分离

15、梯度的介质分离pI不不同的蛋白质同的蛋白质o 分辨率分辨率pI相差相差0.01-0.001 适用适用o 研究蛋白质微观不均一性研究蛋白质微观不均一性o 测定蛋白质等电点测定蛋白质等电点 操作形式操作形式:水平平板、水平平板、(管式管式)获得获得pH梯度梯度o 人工人工pH梯度梯度:不稳定，可用于制备不稳定，可用于制备o 自然自然pH梯度梯度 载体两性电解质：一系列载体两性电解质：一系列pI不同的多氨基多羧不同的多氨基多羧基混合物基混合物(合成过程产生连续变化的氨基羧基比合成过程产生连续变化的氨基羧基比)不同不同pH范围范围NH2-R-COO-NH2-R-COOHNH3+-R-COOH-高高pH

16、电极液电极液+低低pH电极液电极液高高pI不同不同pI混合物混合物低低pI高高pH 两性缓冲两性缓冲 低低pH 等电聚焦等电聚焦 支持介质支持介质o 聚丙烯酰胺应用较多聚丙烯酰胺应用较多o 避免分子筛作用避免分子筛作用o 薄膜薄膜-散热与经济散热与经济 加样方式加样方式 放大作用放大作用 检测检测o 固定固定o 脱色：除去两性电解质脱色：除去两性电解质o 染色染色六、双向电泳六、双向电泳 2DE 第一次电泳后，在垂直方向再进行一次第一次电泳后，在垂直方向再进行一次电泳电泳 单向电泳单向电泳100种蛋白质种蛋白质o 双向电泳双向电泳5000-8000种蛋白质种蛋白质(圆点圆点)组合方式：组合方式：o 第一向等电聚焦第一向等电聚焦(pI)，第二向，第二向SDS-聚丙烯酰胺均匀聚丙烯酰胺均匀/梯度胶电泳梯度胶电泳(Mr分离分离)为多为多I.E.F.and 2D GEhttp:/ 将样品转移到固相载体上，而后利用相将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品应的探测反应来检测样品o 分离：高分辨电泳技术分离：高分辨电泳技术o 检测：灵敏、专一的免疫探测技术检测：灵敏、专一的免疫探测