实验室无菌环境的监控和检测.docx

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1、实验室无菌环境的监控和检测微生物检测人员天天都需要在无菌室工作，在超净台或者生物安全柜里操作，为了保证我们检测的准确性，我们必须要求无菌室以及工作台符合要求，那我们应该怎样进行验证呢？一、紫外灯杀菌效果检查紫外灯在使用过程中辐射强度会逐渐降低，影响其杀菌效果，故应该定期检查。紫外灯的杀菌有效波长是253.7nm,其强度可以用中心波长254nm的紫外线强度计测定。在没有紫外线强度计的情况下可以采用生物学替代。生物学测试简要步骤如下：选用枯草芽泡杆菌ATCC9372,制成lOcFU/mLlOCFU/mL浓度的菌悬液；选用经脱脂处理的0.5CnIXLoCm大小的布片或铝片，高压灭菌后用作载体；每个载

2、体上滴一滴制备好的菌悬液，干燥后备用；将8个染菌载体放于无菌器皿中，置于紫外灯下InrL5m处，开启紫外灯照射，于0.5h、lh、1.5h和2h各取出2个染菌载体，分别投入盛有5mL缓冲蛋白陈水的洗脱液；系列稀释后进行平板计数；同法取8个染菌载体用做阳性对照，操作除不经紫外此昂照射外与试验组相同。杀灭率二（阳性对照回收菌数-试验组回收菌数）/阳性对照回收菌数XlO0%杀灭率大于99.9%时，认为紫外灯杀菌效果合格。二、无菌室空气质量检查无菌室空气质量检查应按照采样计划，根据情况对处于空态、静态和正常运行的风险区，使用适当的仪器采集空气中微生物，测定并监控风险区空气的微生物污染。空气悬浮微生物的

3、采样和计数方法多种多样，根据多需采样目的决定具体的采样方法和采样器。因采样器的采集效率不同，应慎重选择合适的方法和设备。采样器分为两类：被动式采样器，如落菌盘；主动式采样器，如过滤采样器、撞击采样器、冲击采样器等。1.沉降法落菌盘等被动式空气微生物采样器不能测量空气中的微生物的总数，而是测量空气中微生物在表面的沉降率。只要确定单位时间落菌盘上微生物的数量，再根据落菌盘的暴露面积与暴露时间之间的关系，即可大致计算出空气中微生物的数量。面积小于30命的室内设一条对角线取3点，在其中心以及两端距墙InI处各取1点；面积大于3011)2的室内房间四面距墙m和中央各放置一个平皿，高度为实验台高度。培养基

4、平皿开盖暴露IonIir1,然后盖上盖子倒放，培养48h,计数每个平皿上的菌落数。日常监控时，可以设定可接受的菌落数限值。一般无菌室所有的取样平皿上的细菌总数应小于15个。空气质量良好的无菌室，通常么个平皿上生长的细菌不超过2个。2.空气过滤法：空气采样除了自然沉降法外，还可以使用专门的主动式采样器。主动式采样器可以评估风险区空气微生物的特征。主动式采样器主要包括过滤采样器、撞击采样器、冲击采样器等。撞击采样器可以分为狭缝式采样器、离心式采样器和针孔式采样器。狭缝式采样器由附加的真空抽气泵抽气，通过采样器的缝隙式平板，将采集的空气喷射并撞击到缓慢旋转的平板培养基表面上，附着的活微生物粒子经过培

5、养后形成菌落，予以计数。离心式采样器由于内部风机的高速旋转，气流从采样器前部吸入从后部流出，在离心机的作用下，空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固形培养条上，经培养后形成菌落，予以计数。过滤式空气采样器是最常用、最简单的空气采样器。过滤式采样器有采样头、滤器、流量计和抽气泵组成。过滤式采样器的结构如图：开动电机后，抽气泵工作，带动空气吸入采样头，空气通过滤器的时候，大于滤膜孔径的颗粒被阻留，当达到预先设定吸气体积后抽气泵停止工作，将滤膜取出转贴到培养基上，培养后计算空气中微生物的浓度。过滤式采样器捕获效率高，但是滤膜材料可能影响微生物的存活率，还有采样阻力大、流量易变的缺陷。在没有空

6、气采样器的情况下，可以自己组装如下图的空气错率采样装置，注意组装连接处必须密不透风。打开图中大瓶的龙头，空气就被抽入无菌水中。待4L水流完，就有4L空气通过小瓶中的无菌水，也就是4L空气中的微生物被留存在50mL无菌水中。无菌吸取ImL过滤的水样进行平板计数，做2个平行。37。C培养48h计数。每升空气中的细菌数为：2个平皿上细菌数量的平均值50/4o三、无菌室物体表面微生物污染检查表面微生物污染的检查需要使用接触器或拭子，获得某表面某时间点的微生物数量。接触器以容器内已知面积的固态培养介质与表面接触，接触面积应大于20cm2,均匀用力将整个营养介质压住表面几秒钟，不得移动。然后将装置放回容器

7、内，再清洁采样表面，清除残留营养物。接触器培养后显现的菌落可以给出原表面微生物的存活状况的镜像“图”。使用拭子更为简单和灵活，用拭子擦拭某个表面，它抹去的微生物数量就可以计算出了。对接触装置触及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采样特别方便。棉拭子的操作方法如下：准备材料：自制无菌棉拭子或购买商品化的无菌棉拭子、内径IOCnIXIoCm无菌规格板、无菌生理盐水、培养基平皿。如果取样物体是平面的，将无菌规格板放在物体表面，用浸湿的无菌棉拭子在无菌规格板空心处横竖涂抹均匀，涂抹时随之转动棉拭子，剪去棉拭子与手接触部分，将棉拭子放入装有一定体积的无菌生理盐水中待检。将采样管敲打80次以上是棉拭子上的细菌充分扩散，做适当稀释，进行平板计数，37。C培养48h计数。细菌总数(CFUcm2)=(平皿上菌落平均数义稀释倍数)/采样面积(cm2)四、人员接触面无菌检查人员与检测对象的接触面主要是手。被检人员洗手消毒后，五指并拢。将浸泡过的棉拭子沿双手指屈从指根到指端往返涂擦两次，涂擦的同时转动棉拭子。剪去操作者手接触部位，将棉拭子放入装有一定体积的无菌室生理盐水中待检。按“无菌室物体表面细菌污染检查”的方法进行样品处理、接种、培养、计数和报告结果。