酸性磷酸酶ACP活性测定试剂盒说明书.docx

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1、酸性磷酸酶（ACP）活性测定试剂盒说明书微量法IOOT/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。漏定原理：在酸性环境中，ACP催化对硝基苯磷酸二钠水解生成4-硝基苯酚，在405nm有特征光吸收；通过测定405nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。自备仪器和用品：酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸健!水。试剂组成和配制：试剂一：液体60mLx2瓶，4保存。试剂二：液体50mLx1瓶，4保存。试剂三：液体50mLx1瓶，4保存。粗胸液提取：1

2、.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆，4、IOooog离心Iomin,取上清液待测。2 .细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（IO4个）：试剂一体积CmD为50（MOOO：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血液可直接测定，或者适当稀释后测定。测定：I.酶标仪预热30min,调节波长到405nmn2.在EP管中加入下列试剂试剂名称（UL）测定管对照管样本1010试剂一90

3、990试剂二90030避光保温30min试剂三400400混匀，吸取2（X）L加入96孔板中，405nm下测定各管吸光值。AA=A测定管-A对照管。注意：每个测定管需做个对照管。ACP活性计算：标准曲线y=73336x+0.0179：R2=0.9996；X为标准品浓度(molmL),y为吸光值AA。1 .血液中ACP活性计算活性单位定义：30C中每亳升血液每分钟催化产生1mol4-硝基苯酚定义为I个酶活单位。ACP活力(molminmL)=(A-O.OI79)7.3336V反总V样=0.4545(A-0.0179)2 .组织、细菌或细胞中ACP活性计算(1)按照蛋H浓度计算活性单位定义：30*

4、C中每克克蛋白每分钟催化产生1mol4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。ACP活力(molminmgProl)=(A-0.0179)7.3336V反总T(V样XCPr)=0.4545(A-0.0179)Cpr(2)按照样本质量计算活性单位定义：3().C中每克组织每分钟催化产生1mol4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。ACP活力(molming鲜重)=(AA-0.0179)7.3336xV反总(WxV样:V样总)=0.4545(A-0.0179)W(3)按照细菌或细胞数量计算活性单位定义：30C中每IO1个细菌或细胞每分钟催化产生1mol4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。ACP活力30101加足/10

5、t41)=(-0.0179户7.3336丫反总?门(细胞数量XV样+V样总)=0.4545(A-0.0179)细胞数量V反总：反应体系总体积(mL),1mL；W：样品质量，g：V样：加入反应体系中样本体积(mL),0.01mL；V样总:提取液体积，1mL；T：反应时间(min),30min；500：细胞或细菌总数，500万。注意项：ACP不稳定，尤其在37C和PH大于7的条件下活力丧失快，因此酸性磷酸酶样品一般需当天准备；血清样品中，每毫升血清中加入IOmg柠檬酸氢二钠或者5mg硫酸氢钠，使PH降至6.5以下，或5ml血清加入30%醋酸溶液23滴，置于4C可保存1周。优利科(上海)生命科学有限