蛋白质工程培训课件.pptx

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1、本课内容本课内容蛋白质的产率问题蛋白质的产率问题蛋白质工程概要蛋白质工程概要蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例蛋白质的产率问题蛋白质的产率问题 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。括载体相关因素和宿主相关的因素。 与载体有关的因素主要有：与载体有关的因素主要有： 表达载体拷贝数的调控表达载体拷贝数的调控 启动子的强弱与转录调控启动子的强弱与转录调控 转录终止子的效应转录终止子的效应 密码子的使用频率密码子的使用频率 信号肽的特征与分泌调控信号肽的特征与分泌调控 影响产率的宿主因素主要有二：影响产率的宿主因

2、素主要有二：mRNAmRNA的稳定性；的稳定性；宿主的蛋白质降解系统。宿主的蛋白质降解系统。载体拷贝数载体拷贝数 通过调控基因拷贝数来提高外源基通过调控基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作因表达产量被称作基因的剂量效基因的剂量效应应，是一个对生产过程产生较大，是一个对生产过程产生较大影响的因素。影响的因素。 在多数情况下可以理解为质粒拷贝在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与数的多少，与oriori有关。在克隆实验有关。在克隆实验中常使用拷贝数中常使用拷贝数100100的多拷贝质粒。的多拷贝质粒。 在以在以E. coliE. coli为宿主的生产中，常使为宿主的生产中，常使用可以根据培养

3、温度调整拷贝数的用可以根据培养温度调整拷贝数的runawayrunaway质粒（如质粒（如pCP3pCP3），），42 42 时时拷贝数最高可达几千个。拷贝数最高可达几千个。lacZampr复制起点复制起点ori启动子的强度启动子的强度 启动子的强度是指一个启动子能启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合够多大程度地结合RNARNA聚合酶并聚合酶并引发转录过程。引发转录过程。 原核基因的启动子主要包括原核基因的启动子主要包括-35-35和和- -1010区，真核基因启动子则主要是区，真核基因启动子则主要是TATATATA盒与一些上游转录活化序列盒与一些上游转录活化序列UASUAS。这些序列

4、被称作。这些序列被称作顺式作用顺式作用元件元件（ciscis序列）。序列）。 一般认为启动子的强度与一般认为启动子的强度与ciscis序列序列的最佳配置相关，在人工构建强的最佳配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试把不同基因启动子时主要是尝试把不同基因的启动子的的启动子的ciscis序列进行重组。序列进行重组。-35-10RNA 聚合酶原核基因启动子原核基因启动子UASTATARNA聚合酶真核基因启动子真核基因启动子启动子启动子 根据表达的方式可以把启动子分为两类：根据表达的方式可以把启动子分为两类： 构成性表达启动子：持续表达构成性表达启动子：持续表达 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达

5、。诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。宿主宿主启动子启动子构成性表达构成性表达诱导表达诱导表达大肠杆菌大肠杆菌E. coliE. colilac, tac, ara pBAD, lac, tac, ara pBAD, P PL L, , T7T7枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蛋白酶、淀粉酶基因蛋白酶、淀粉酶基因的启动子的启动子酿酒酵母酿酒酵母S. cerevisiaeS. cerevisiaeADH1ADH1，TDH3TDH3GAL1GAL1，PHO5PHO5毕赤酵母毕赤酵母P. pastorisP. pastorisGAPGAPAOXAOX诱导性表达诱导性表达 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，

6、但是随着强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着mRNAmRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。宿主细胞有毒性的话就更是如此。 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。才进行强力表达的诱导性启动子。 E. coliE. coli的诱导表达系统几乎全部是利用的诱导表达系统几乎全部是

7、利用E. coli E. coli 来源来源的各种操纵子中的启动子，如的各种操纵子中的启动子，如laclac启动子。启动子。E. coli E. coli 的乳糖操纵子的乳糖操纵子lac operonlac operon 乳糖操纵子包含启动子乳糖操纵子包含启动子P Placlac、操纵、操纵基因基因O O和和3 3个结构基因个结构基因lacZlacZ：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacYlacY：-半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶lacAlacA：-半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷转乙酰酶 操纵子上游的操纵子上游的lac I lac I 编码阻遏蛋白编码阻遏蛋白。lac Ylac Ylac Alac AO Ol

8、ac Ilac Ilac Zlac ZP Placlac乳糖操纵子乳糖操纵子调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因P P 异乳糖异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和和DNADNA的亲和性降低，不能与的亲和性降低，不能与操纵基因操纵基因O O结结合，对合，对P Placlac的阻遏的阻遏被解除，被解除，lac lac Z Z等基因等基因的转的转录得以进行录得以进行。 IPTGIPTG：异乳糖的类似物，可作为：异乳糖的类似物，可作为laclac启动子启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子一直被诱导。一直被诱导。阻

9、遏蛋白阻遏蛋白乳糖乳糖, , LactoseLactose转录转录lac Ylac Ylac Alac AO Olac Ilac Ilac Zlac ZP PlaclacP PIPTGIPTG异乳糖异乳糖转录终止子转录终止子 从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地耗费能量。会额外地耗费能量。 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质粒的稳定性下降。使质粒的稳定性下降。 因此为了提高生产性能，往往会在

10、目的基因下游添因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添加终止子序列。如加终止子序列。如E. coliE. coli中的中的rRNArRNA基因基因rrnBrrnB的终止的终止子、子、T7T7噬菌体的终止子等。噬菌体的终止子等。目的基因目的基因SDSD启动子启动子终止子终止子密码子使用频率密码子使用频率 不同物种对各种密码子的使用频不同物种对各种密码子的使用频率不同，原因之一是细胞中各种率不同，原因之一是细胞中各种tRNAtRNA分子所占的比例不同。分子所占的比例不同。 在工业水平的生产中，密码子的在工业水平的生产中，密码子的选择会明显地影响蛋白质的纯度选择会明显地影响蛋白质的纯度和产量。基

11、因中如果高频率出现和产量。基因中如果高频率出现对应于少量对应于少量tRNAtRNA的密码子，蛋白的密码子，蛋白产量会明显降低。产量会明显降低。 因此一条重要的基因设计原则就因此一条重要的基因设计原则就是要选择是要选择最适密码子最适密码子：对应于最：对应于最多多tRNAtRNA分子的密码子。分子的密码子。 GCA GCA GCG GCG GCC GCC GCU GCU丙氨酸的同义密码子丙氨酸的同义密码子tRNAtRNA信号肽与分泌生产信号肽与分泌生产 外源蛋白质在宿主菌中表达外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，时可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白则可能因过剩表另一些蛋白则可能因过剩

12、表达而形成不溶性的包涵体。达而形成不溶性的包涵体。 采用细胞外分泌的方法生产采用细胞外分泌的方法生产是避免上述情况发生的有效是避免上述情况发生的有效手段。手段。 分泌至细胞外的目的蛋白不分泌至细胞外的目的蛋白不仅可以正确折叠，而且表达仅可以正确折叠，而且表达量较高，并有利于分离与精量较高，并有利于分离与精制。制。乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母信号肽信号肽 信号肽位于分泌蛋白质的信号肽位于分泌蛋白质的N-N-末端，由末端，由1530aa1530aa组成，组成，末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽：母蔗糖酶信号肽： 信号肽的重要性就在

13、于它是蛋白质向细胞外分泌的信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信号肽进行蛋白分泌表达的载体。号肽进行蛋白分泌表达的载体。 细菌中细菌中B. subtilis B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母母S. cerevisiaeS. cerevisiae、P. pastorisP. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较和曲霉属的霉菌则是比较适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。MLLQAFLLAGFAAKISA SN N宿主的

14、蛋白降解系统宿主的蛋白降解系统 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶缺陷的突变株。白酶缺陷的突变株。 如如E. coli BL21E. coli BL21（DE3DE3）是基因表达实验中最常与是基因表达实验中最常与pETpET系列质粒配合使用的宿主菌，系列质粒配合使用的宿主菌，B B株系天然缺失株系天然缺失lonlon蛋白酶（蛋白酶（K12K12有）。研究人员又向其引入了蛋白有）。研究人员又向其引入了蛋白酶酶OmpTOmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产

15、量。的缺失突变，有利于提高蛋白产量。 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GSTGST，谷胱甘肽硫转移酶）通过谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合基因融合的方法进行融合的方法进行融合表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。融合蛋白表达融合蛋白表达 蛋白质的在结构与功能上蛋白质的在结构与功能上都具有模块化的特点，其都具有模块化的特点，其结构域往往在结构和功能结构域往往在结构和功能上都有相当的独立性。上都有相当的独立性。 这就使通过这就使通过DNADNA重组技术重组技术产生融合蛋白质成为可能。产生融合蛋白质成为可能。 这种技术在

16、实验室中也常这种技术在实验室中也常被用于目的蛋白的亲和层被用于目的蛋白的亲和层析纯化（例如：与析纯化（例如：与GSTGST、HisHis标签、标签、GFPGFP等蛋白融等蛋白融合）。合）。ORFORF基因融合基因融合基因基因A A基因基因B BORFORF转录转录mRNAmRNA翻译翻译融合蛋白融合蛋白amproriGST目的蛋白目的蛋白SDpT7pT7T7T7终止子终止子placT7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶IPTGIPTG宿主宿主E. coli BL21(DE3)E. coli BL21(DE3)染色体染色体表达载体表达载体T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶 以融合蛋白形式进行表达的以融合蛋白形式进行表达的额外的好处是可以对目标蛋额外的好处是可以对目标蛋白进行亲和层析纯化，能大白进行亲和层析纯化，能大大简化蛋白的纯化过程。大简化蛋白的纯化过程。融合蛋白的亲和层析法纯融合蛋白的亲和层析法纯化化树脂颗粒树脂颗粒GST谷胱甘肽，谷胱甘肽，GSHGSH谷胱甘肽硫转移酶谷胱甘肽硫转移酶GST目标蛋白目标蛋白GSTGST结合结合GST洗脱洗脱蛋白酶蛋白酶GST蛋白质工程蛋白质工程 随着