生物化学检验常用技术.pptx

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1、第三章第三章 生物化学检验常用技术生物化学检验常用技术第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术吸收光谱分析技术吸收光谱分析技术发射光谱分析技术发射光谱分析技术散射光谱分析技术散射光谱分析技术一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法40.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器显示器钨灯、卤钨灯 3501000氢灯、氘灯 180360滤光片棱镜光栅玻璃比色皿石英比色皿5( (一一) )、分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理1 1、吸光度、吸光度与透光度与透光度 A A = - = -lgTlgT = - = -lgIlgI/I/I0 0 = lgI= lgI0 0/I/I 当光

2、线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一一部分光部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I I0 0，透射光强度为透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即：T = I/IT = I/I0 0 T T100%100%为为T%T%称为百分透光度。透光度的负对数称为称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度吸光度即：即：入射光入射光 I I0 0透射光透射光 I I62 2、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律La

3、mbert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础分光分析的理论基础。 A = KLCA A 为为吸光度吸光度；K K 为为比例常数，称为吸光系数比例常数，称为吸光系数；L L 为溶液层为溶液层厚度，称为光径厚度，称为光径；C C 为为溶液浓度溶液浓度 Lambert-BeerLambert-Beer定律适用于定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体液体当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。厚度和溶液

4、浓度成正比。L LLambert-Beer定律定律适用于适用于: :可见光可见光、紫外光、红外光和均匀非散射、紫外光、红外光和均匀非散射的的液体以及分散均匀的固态或气态样品液体以及分散均匀的固态或气态样品. .单色光单色光 均匀介质均匀介质吸收物质无相吸收物质无相互作用互作用3 3、Lambert-BeerLambert-Beer定律的应用条件定律的应用条件4 4、Lambert-BeerLambert-Beer定律的偏离现象定律的偏离现象溶液：稀溶液、化学变化溶液：稀溶液、化学变化光学光学; ; 非单色光、散射和折射非单色光、散射和折射仪器仪器; ; 光源、实验条件光源、实验条件 在分光光度

5、法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、抵消比色皿和试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。5 5、空白溶液的选择、空白溶液的选择 蒸馏水 试剂样品不含待测元素 不显色1、溶剂空白溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。2、试剂空白试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。3、样品空白样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选

6、择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。 选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。 选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。( (二二) )、分光光度法在生化检验中的应用、分光光度法在生化检验中的应用灵敏

7、度高、操作简便、应用广泛1、对未知化合物进行定性分析、对未知化合物进行定性分析2、对待测物质进行定量测定、对待测物质进行定量测定定性依据：最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 标准曲线法和比较法11(1).(1).标准曲线法标准曲线法 根据根据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，

8、作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标为横座标，以吸光度为纵座标，将，将对应各点连成一条通对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为过原点的直线，这条直线称为标准曲线标准曲线。待测溶液测定。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。u方法：5.5.标准溶液设置的浓度范围足够大。标准溶液设置的浓度范围足够大。132 2比较法比较法 C CR R=(A=(AR R C Cs s)/A)/As s 己己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同

9、时，同时测测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品标准品浓度，可直接浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：计算出标本的浓度，计算公式为：二、发射光谱分析法二、发射光谱分析法 处于激发态的待测元素，原子回到基态时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量分析的方法。发射光谱是指样品本身产生的光谱被检测器接收；吸收光谱是光源发射的光谱被样品吸收了一部分，剩下的那部分光谱被检测器接收。火焰光度法荧光光度法火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所

10、发射的辐射强度来进行定量分析的方法。元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分析法它是一种简化的发射光谱分析法（一）、火焰光度法（一）、火焰光度法FP640火焰光度计火焰光度法分析示意图火焰火焰光度法的特点光度法的特点应用范围窄灵敏快速准确设备简单试样溶液于数分钟内可完成测定火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106 g被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单主要用于碱金属和部分碱土金属的测定1、激发条件影响火焰光度分析的因素影响火焰光度分析的因素2、试样的

11、种类和组成3、试液中共存离子对测定有影响4、仪器的质量火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。（二）、荧光分光光度法（二）、荧光分光光度法化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。荧光产生的原理：荧光分光光度法分析测定蛋白质、核酸、维生素等;对某些激素及其代谢产物的测定;当化合物含量太少,一般分析方法灵

12、敏度不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。三、散射光谱分析法三、散射光谱分析法透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的光信号与仪器的检测器有区别。1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。光的散射用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来。散射光谱分析法利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析

13、的方法。第二节第二节 电化学分析技术电化学分析技术一、电位分析法一、电位分析法 ISE利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。电位分析法电位分析法一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子有选择性响应的电化学传感器离子选择电极离子选择电极 ISE电解质溶液中参与电化学反应的离子的有效浓度 离子选择性电极的类型和品种很多，外形也差异很大；但基本结构都包括：对特定离子有选择性响应的薄膜(敏感膜或传感膜)、内参比溶液与内参比电极。 敏感膜将内侧参比溶液与外侧的待测离子溶液分开，是电极的关键部位。 ISE基本基本结构结构内参比电极内参

14、比电极电极壳体电极壳体内参比溶液内参比溶液敏感膜敏感膜离子选择性电极离子选择性电极结构示意图结构示意图电极电位电极电位电极电位测量电极电位测量在电位分析中，构成电池的在电位分析中，构成电池的两个电极，其中一个，其电两个电极，其中一个，其电位值随待测离子浓位值随待测离子浓( (活活) )度的度的变化而变化，能指示待测离变化而变化，能指示待测离子的浓子的浓( (活活) )度，称为度，称为指示电指示电极极，或，或离子选择性电极离子选择性电极。指示电极指示电极而另一个电极，其电而另一个电极，其电位不受试液组成变化的位不受试液组成变化的影响，具有较恒定的数影响，具有较恒定的数值，只是作为测量电位值，只是

15、作为测量电位的标准，称为参比电极的标准，称为参比电极( (参考电极参考电极) )。 参比电极参比电极离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极；离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极；能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。 选择性好选择性好 在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往不需要分离处理就可直接测定。不需要分离处理就可直接测定。

16、 灵敏度高灵敏度高 电位法的检出限为电位法的检出限为1010-5-51010-8 -8 mol/Lmol/L，适于微量组分的测，适于微量组分的测定，电位滴定法适于常量分析。定，电位滴定法适于常量分析。 快速快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，易于实现分析自动化。易于实现分析自动化。 缺点缺点 需要有专用的离子选择性电极。需要有专用的离子选择性电极。电位电位分析法的特点：分析法的特点： 根据国际纯粹及应用化学联合会根据国际纯粹及应用化学联合会( (IUPAC) )的建议，离子选的建议，离子选择性电极一般采用如下分类：择性电极一般采用如下分类： 常用的离子选择电极常用的离子选择电极玻璃膜电极玻璃膜电极气敏电极气敏电极如如，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气(由醋酸纤维、聚四由醋酸纤维、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。测定时，。测定时，CO2气体通过微孔渗透膜与中气体通过微孔渗透膜与中介溶液接触介溶液接触(中介液是中介液