分子生物学常用技术.ppt

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1、目目 录录常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application目目 录录第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology目目 录录核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一放在

2、一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形关系，就可以在不同的分子之间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目目 录录复性复性RNADNA目目 录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判膜上的核苷酸结合，判断

3、是否有同源的核酸分子存在。断是否有同源的核酸分子存在。 目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 目目 录录n直接法：优点： 1.快速（一种抗体） 2.没

4、有二抗交叉反应引起的非 特异性条带缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵目目 录录n间接法：优点：1.信号放大， 2.灵敏度高（多个二抗结合 位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.免疫特异性不受标记影响5.可选择不同的Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异 性条带2.额外的二抗孵育以及条件 优化目目 录录Y YY YHRPHRPHRPHRPHRPHRPSuperSignalSuperSignal 底物与二抗底物与二抗HRPHRP反应发光反应发光5SuperSignalHRPHRP标记二抗与一抗蛋白复标记二抗与一抗蛋白复合物结合合物结合42漂洗和封闭漂洗和封闭

5、1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上3一抗与蛋白结合一抗与蛋白结合 ( (小鼠单抗小鼠单抗 或兔多抗或兔多抗) )目目 录录 其他其他斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)目目 录录第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5

6、5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分目目 录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三

7、）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目 录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录目目 录录三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行种双脱氧核苷酸，然后进行Sa

8、nger测序反应，反测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 目目 录录DNA自动测序结果举例目目 录录目目 录录基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节目目 录录基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library

9、) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。目目 录录基因组基因组DNA文库文库目目 录录目目 录录第第 六六 节节遗传修饰动物模型的建立遗传修饰动物模型的建立及应用及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 目目 录录转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，

10、使之发育成个体。宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术目目 录录目目 录录核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物体细胞，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆( (clone)。二、核转移技术二、核转移技术目目 录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭活，灭活，有目的去

11、除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术目目 录录四、基因转移和基因剔除技术在四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型目目 录录第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology目目 录录DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特

12、定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)目目 录录目目 录录目目 录录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(prot

13、ein chip)目目 录录第第 八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术Research Technology of Interaction of Protein目目 录录蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质

14、之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用研究的重要性目目 录录酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术目目 录录荧光共振能量转换技术荧光共振能量转换技术一、酵母双杂交技术的基本原理一、酵母双杂交技术的基本原理目目 录录目目 录录 二、酵母双杂交系统的应用二、酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用（五）在药物设计中的应用