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1、ICS65.150CCSB52DB50重庆市地方标准DB50.T16062024水生动物细菌性病原鉴定技术规范2024-07-08布2Q241(HB实苣庆市市场监督管理局发布本文件按照GB11.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草.本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的员任，本文件由重庆市水产技术推广总站提出.本文件由重庆市农业农村委员会归口并组织实施.本文件起草单位：柬庆市水产技术推广总站、中国水产科学研究院长江水产研究所、西南大学、S庆市水产学会.本文件主要起草人；张利平、王波、李虹、悔会济、怅旭亮、周出、用雨华、陈沽、马龙强、冯
2、俊、薛明洋、薛洋、具晓清、周春龙、何忠谊、徐凤、甘姆婢、陈波、刘晓莉、梅建西，水生动物细性病原签定技术规范1本文件规定r水牛.动物细储性病原饕定的试剂、仪零设分、签定方法和无害化处理等技术要求.本文件适用于水生动物细菌性病原签定和相关疫宿诊断，2提范性引用文件下列文件中的内容翊过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该H期对应的版木适用于本文件：不注FI期的引用文件，其最新版本(包括所有的修通单)适用于本文件.GBT6682分析实验室用水规格和试腕方法SC1T7015病死水生动物及病害水牛.动物产品无害化处理规范SuT7201.1鱼类细菌性病检疫技术规程第1部分
3、：通用技术3术褥和定义本文件没有衢要界定的术语和定义.4下列缩略法适用于本文件。PCR:聚合他钺式反应(Po1.ymeraSeChainReaction)iiNTP:脱氧核燃核苛三硝酸(DeOXy-ribonuc1.eosideTripbosphate)TAE:：泾甲基1.睦甲烷心酸fit(TriMhydroxynw1.hy1.)amInomCIhaneAcetateSa1.OEDTA:乙：胺四乙酸(E1.hy1.eneDiamineTetiaaceticAcid)BH1.:脑心浸出液肉汤(BrainHcanInfusionBroth)BHIA:IW心浸出液琼脂(BrainHeartInfus
4、ionAgdr)DEPC:1匕碳酸：乙曲(Dicthypyrocarbonatc)5试剂实验用水、TaqDXA聚合酪.dNTP.琼脂糖.10XPCR线冲液(含好1.25IUS1/1.)、核酸染料、HHkB1.I1.A.试剂配制见附录A.实5用水应符合GB/T6682中一级水的规定.6仪设备超挣I.作台.生物安全柜、医用冰箱、高速高心机(100rpm-2()(0()m),高乐灭菌网.PCR仪.电泳仪、凝般成像仪、生化培养箱、移液器等，7整定方法7.1 样=7.1.1 同一采样点每尾（只）动物个体视为一个样本，同一采样点同一次枭集的相似临床症状的样本不超过5个.优先采集布代我性的样本,即采集具有明
5、显临床症状的发病动物或齐高郡、独游、濒死的动物7.1.2 用75%泗精时待检测水生动物的表面进行擦拭消律.7.13 放置于己消曲解剂盘中，观察样品右床症状，若有，则用灭曲接种环或剪刀挑取部分病灶如织；若无病变,用灭菌剪刀和银子，分别取肝、脾、肾等趾织.7.14 物做分H及纯化7.14.1 在超净工作台或生物安全柜中,用灭菌接种环前取病灶部位或其它用织在BHIA平板（或选择性培养基或血平板）上进行三区划税，做好编号标记，7.14.2 划线好的平板倒置在培养箱中.28C2C培养16h24h.7.14.3 观察扁落生长情况，挑取优势单曲落（参见附录B图B.1）.在超净工作台或生物安全柜中用无苗接种环
6、挑取单苗落到装有无由BH1.增能液（或己知的适宜培养务）的曲心管中（个单的落对应一个漓心管），做好编号标记.挑取的不是单菌落，可稀糅后曳复划线纯化.7.14.4 将挑取的单菌落放置在培养箱中，28C2C培养】6h24h.观察阳液状态，若浑浊，则于4C保存待检。7.15 WMM*73.1吸取300U1.的单菌落地荫液于无菌离心管中.1200OrPmZmin寓心2min.弃上清.7.3.2加入3001.的双蒸水，洗脱.12000rp11min窗心2min;曳复一次.弃上清.7.3.3离心管中加入30。从1.的双排水，10Oc金属浴（或水浴）10in,取出后马上放入冰中冷却，等冷却后4C、1200O
7、r禹心IOmin,吸收上清液作为核酸模板，放至无菌的离心管中冷藏备用：也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其它方法抽提IM.7.47.4.1 16SrDXMM5tt上游引物27-F5AGAG11TGATCCTGGCTCAG3:下游弓I物I1.92-R5GG11ACCTGTACGAE-3.7.4.2 反应体系1艘反感体系反应试剂加样体枳IOXPCRiS冲液（含时）5H1.HXTPU1.上游引物】U1.下游少物1U1.TaqWiN聚合防0.5U1.模板2.5U1.1PCRft虚体系（反应试剂加样体枳双煎水或mc水：W1.R体枳50II1.7.4.3 反应条件911预变性3min.94匕30s;55
8、-C30s:72t70s：Ir增32个循环：72C10min.最后4匕保淑.7.4.4用IXTAE电泳谈冲液配置1.5%的琼阳虢援股，将5U1.样拈和IU1.6上样馔冲液混匀后加入样品孔.在电泳时设立核酸标准分子量作对照.5V/cm电泳约0.5h,当澳酚就快到达琼脂糖凝胶底部时，停止电泳.将琼脂触凝胶浸入核酸染料中进行泡染15min.于TAE缓冲液中脱色15min.将凝胶置广凝股成像仪上观察。站果判定：阳性对照16SrDNA的扩增产物在1500bp处出现特异性条带，DNA分子债标准条清楚，W性对照和空白对照无特异性条带,价测样品出现1500bp的特异性核酸条带，则可进行荔因测序（侍测样品出现1
9、500bp的特异性核酸条带每见用录B图B.2）.否则无效.7.4.5 苔因震停取PCR产物进行基闪序列测定.格测序结果勺基因Bank中参考序列进行同源性比对.7.4.6 MVMttiime*葩因Bank进行向源性比对，根据比对结果判定细雨种国.8无化处，实验过程中所用的零皿.耗材、及产物均需要经过121C.15min高乐灭菌后.方可处置.实验后水生动物及其组织无害化处理按照3。T7015煨定执行.9生物安全防妒实货人处必须穿着合适的实整果、佩戴好口罩.、帕子及次性手套.进行活体处理或接触含有微生物的物品后，要洗手，离开实验室前要脱掉手套，次性F套不得清洗和再次使用.如果发生污染性物质溢出等事故
10、，应及时向实验空负贵人报告，并记录经过和处理方案，禁止在实验室饮性、吸烟、化妆、铭存仅物.非工作人员禁止迸入实验室.DB50T16062024A.150XTAE起Ht冲液IInOI/1.冰乙酸57.1m1.2Iiw1.1.TrisW242g100rnmo1.1.EDT200m1.的。.5InOIZ1.EDT(p1.1.8.0)加水定容至100om1.室温贮存。A.21XTAE电泳冲液加入5QX电泳援冲液20m1.并加水定容至100Om1.,因胜成工作液，室温贮存.A.36X上祥冲液成聃40g浪阴优0.25g加1水溶解，定容至100m1.附录B16SrDNMt异性Pa0*好图氏1单菌落螫考图见图BJ.BBb.i单#图B.216SrDNA特异性PCR琼的处电泳图见图B.2,MarkerPNNTP：阳性对照:N:阴性对照：NT:空白样品：I:菌样SB.216SrDNA转鼻性PCRMiH
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