流式细胞术的临床应用.ppt

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1、流式细胞术介绍流式细胞术介绍利用利用流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometry, FCM）对处在快速、）对处在快速、直线、流动状态中的直线、流动状态中的单个微粒单个微粒多参数、快速定量分析，多参数、快速定量分析，也可以同时对特定群体进行也可以同时对特定群体进行分选分选的技术的技术分析对象包括分析对象包括细胞、细菌、荧光微球细胞、细菌、荧光微球等，等，0.4 m40 m六种技术：六种技术：激光技术、电子物理技术、激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、电子计算机技术、光电测量技术、电子计算机技术、 细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术四个系统：四个系统：液流系

2、统、光学系统、液流系统、光学系统、 电路系统、分析系统电路系统、分析系统激光源激光源计算机分析计算机分析滤光片滤光片（长通、短通、带通）（长通、短通、带通）包括流动室、包括流动室、鞘液和样本流鞘液和样本流信号检测器信号检测器BD FACSCalibur双光源，双光源，488nm和和633nm可同时检测四种抗原可同时检测四种抗原可分选（理论上）可分选（理论上）散射光信号散射光信号前向散射光（前向散射光（forward scatter light, fsc ） 反映细胞大小反映细胞大小侧向散射光（侧向散射光（side scatter light, ssc） 反映细胞内部颗粒、核膜等反映细胞内部颗粒

3、、核膜等FSC检测器检测器SSC检测器检测器外周血裂红后外周血裂红后FSC/SSC分布分布 R1: 淋巴细胞淋巴细胞 R2: 单核细胞单核细胞 R3: 中性粒细胞中性粒细胞 R4: 裂解碎片裂解碎片荧光信号荧光信号抗原抗原抗体抗体荧光素荧光素激光束激光束抗原抗体反应抗原抗体反应单克隆荧光抗体标记单克隆荧光抗体标记不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激发光波长有所不同发光波长有所不同设门（设门（gating）：根据某些特性将分析细胞群根据某些特性将分析细胞群圈起来。圈起来。 淋巴细胞：淋巴细胞：FSC/SSC CD45+/SSCdim T淋巴细胞：淋巴细胞：

4、CD3+/SSCdim单参数分析单参数分析横坐标：横坐标：信号强度信号强度纵坐标：纵坐标：细胞数量细胞数量双参数分析双参数分析横、纵坐标代表的均是横、纵坐标代表的均是信号强度信号强度UL: cd3-cd4+ UR: cd3+cd4+LL: cd3-cd4- LR: cd3+cd4-FCM的临床应用的临床应用标本来源：标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细及其脱落细胞。胞。 血清和各类体液样本（可溶性蛋白）血清和各类体液样本（可溶性蛋白）CSF、BALF、胸腹、胸腹水等水等： 过滤、离

5、心后制过滤、离心后制成单细胞悬液，并调成单细胞悬液，并调整目标细胞浓度约整目标细胞浓度约106/ml骨髓、红细胞骨髓、红细胞： 调整样本中目标调整样本中目标细胞浓度细胞浓度106/ml50100l标本标本(血小板血小板15l)+荧光抗体荧光抗体室温，避光，抗室温，避光，抗体孵育体孵育20min(胞内因子检测胞内因子检测需置需置4)如果需要破坏如果需要破坏样本中红细胞样本中红细胞： 加入加入1ml红细胞裂解液红细胞裂解液避光，避光，10min离心弃上清，离心弃上清，加入加入PBS，混，混匀后离心，弃匀后离心，弃去上清用去上清用400 l PBS充悬，充悬，避光待上机。避光待上机。胞内抗原检测胞内

6、抗原检测： 按照说明书加入固定剂、按照说明书加入固定剂、破膜剂及胞内荧光抗体，避光破膜剂及胞内荧光抗体，避光反应反应3040min。已开展的项目已开展的项目淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群 HLA-B27CD55、CD59检测检测CD34造血干细胞计数造血干细胞计数白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型杂项（杂项（BALF、胸腹水等、胸腹水等CD分子检测）分子检测） TH1/TH2细胞检测细胞检测血小板活化血小板活化炎症感染指标炎症感染指标CD64CBA网织红细胞网织红细胞/血小板检测血小板检测微小残留病灶（微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡细胞凋亡 其他临床应用

7、其他临床应用试剂试剂：BD IMK-Lymphocyte Kit标本标本：外周血（常用）：外周血（常用）检测指标检测指标：T细胞（细胞（CD3、CD4、CD8） B细胞（细胞（CD19） NK细胞（细胞（CD3-CD1656）临床意义临床意义：体内免疫状态：体内免疫状态 判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染 SCID、AIDS、 SLE、RA 急性急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤移植排斥、恶性肿瘤 免疫球蛋白缺乏症或分泌过多免疫球蛋白缺乏症或分泌过多 结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变 AIDS试剂试剂：BD

8、 HLA-B27 Kit 标本标本：外周血外周血检测指标检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上淋巴细胞上HLA-B27 定性检测定性检测临床意义临床意义：强直性脊柱炎强直性脊柱炎（高度相关高度相关） 遗传性关节炎遗传性关节炎 Reiters 综合征综合征 反应性关节炎、银屑病关节炎反应性关节炎、银屑病关节炎 急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、试剂试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本标本：外周血（红细胞、白细胞）外周血（红细胞、白细胞）检测指标检测指标：CD55、CD59百分比百分比 CD55、CD59荧光强度荧光强度临床意义临床意义： 阵发性睡眠性血红蛋白尿

9、（阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH） 酸化血清溶血试验（酸化血清溶血试验（Hams试验）试验） 糖水试验糖水试验 蛇毒因子溶血试验蛇毒因子溶血试验 补体溶血敏感实验补体溶血敏感实验 FCM检测（金标准）检测（金标准）以红细胞检测为例以红细胞检测为例normalPNH试剂试剂：BD Procount Progenitor Cell Enumeration Kit标本标本：骨髓、动员后的外周血：骨髓、动员后的外周血检测指标检测指标：CD34及浓度及浓度蓝色蓝色荧光微球（数量已知）；荧光微球（数量已知）；红色红色CD34细胞细胞干细胞特征：干细胞特征： CD45表达弱表达弱阴性阴性 (R2) CD34

10、表达弱表达弱强强 (R4) DNA/RNA含量多，染色性较强含量多，染色性较强 (R1) 大小（大小（FSC）和颗粒度（）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似）淋巴细胞相似临床意义临床意义： 血液系统疾病的造血干细胞移植血液系统疾病的造血干细胞移植 数量的检测数量的检测 采集时机的确定采集时机的确定 某些肿瘤某些肿瘤 试剂试剂：各种单克隆荧光抗体：各种单克隆荧光抗体标本标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织检测指标检测指标：我室目前开展了将近：我室目前开展了将近40种指标的检测种指标的检测 可满足大部分可满足大部分L&L的分型要求的分型要求分型方案分型方

11、案：CD45设门，四色标记，设门，四色标记，临床意义临床意义： 客观、快速地分析客观、快速地分析 确定异常细胞系来源及分化阶段确定异常细胞系来源及分化阶段 区分双克隆或双表型的区分双克隆或双表型的HAL 判断预后判断预后正常骨髓细胞正常骨髓细胞CD45/SSCR1: 淋巴细胞淋巴细胞R2: 幼稚细胞幼稚细胞R3: 单核细胞单核细胞R4: 中性粒细胞中性粒细胞R5: 有核红细胞有核红细胞AML-M1R2占占94，表达，表达cd33,cd34,cd117,cd71,cd13,cd64,mpoALL(B)R2占占65，表达，表达cd79a,cd19,cd34,cd22,cd10,cd38,hla-d

12、rMMR2占占17，表达，表达cd38(+),ckappa轻链轻链临床意义临床意义： 结节病和特发性肺间质纤维化结节病和特发性肺间质纤维化 肺部肿瘤疾病肺部肿瘤疾病cd4/cd85.04TH1，抗胞内病原体 迟发型超敏反应、炎症 IL-2、IFN-、TNF- 介导介导细胞免疫细胞免疫 CD4+TTH1/TH2TH2，蠕虫感染 环境变应原的应答 IL-4、IL-5、IL-10等等 介导介导体液免疫体液免疫 细胞内细胞因子表达细胞内细胞因子表达 IFN-和和IL-4 检测前需要刺激活化（检测前需要刺激活化（PMA + Lonomycin） Golgistop，含有莫能霉素（，含有莫能霉素（Mone

13、nsin） 设门策略：设门策略：CD3+CD8-FCM在血栓与止血在血栓与止血疾病中的应用疾病中的应用CD41CD61PAC-1CD42aCD42bCD62P即血小板膜即血小板膜蛋白蛋白GPb/a聚集功能聚集功能血小板无力血小板无力症（症（GT）即血小板膜蛋白即血小板膜蛋白GPIb/IX黏附功能黏附功能巨血小板症巨血小板症（BSS）血小板相血小板相关免疫球关免疫球蛋白蛋白即血小板自身抗即血小板自身抗体体PAIg特发性血小板减特发性血小板减少性紫癜（少性紫癜（ITP） GMP14O、P-选择素选择素活化标志物活化标志物动脉血管病动脉血管病 血栓性疾病血栓性疾病 注意事项注意事项：避免血小板的体外

14、活化：避免血小板的体外活化 使用真空采血管使用真空采血管 枸橼酸钠，避免使用枸橼酸钠，避免使用EDGA和肝素和肝素 尽快检测或分离血小板尽快检测或分离血小板 固定固定CD64：FC受体受体 单核细胞（）单核细胞（） 中性粒细胞（中性粒细胞（dim） 淋巴细胞（淋巴细胞（）检测指标检测指标：中性粒细胞：中性粒细胞CD64表达强度表达强度 CD64指数指数CD64中性粒中性粒/CD64淋巴淋巴临床意义临床意义：细菌感染、脓毒血症、败血症：细菌感染、脓毒血症、败血症CBA： 可溶性蛋白可溶性蛋白 如：血清中细胞因子如：血清中细胞因子 荧光微球连结特异抗体荧光微球连结特异抗体 不同荧光强度不同荧光强度

15、 多个检测指标多个检测指标标本标本：血清、血浆、培养液、各种体液：血清、血浆、培养液、各种体液FCM的质量控制的质量控制 保养：防尘、保护激光源、液路冲洗保养：防尘、保护激光源、液路冲洗 仪器的校准仪器的校准 CaliBRITE beads 光路稳定性光路稳定性 PMT的转换的线性的转换的线性 多色补偿设定多色补偿设定 时间延迟时间延迟 灵敏度灵敏度 抗凝剂抗凝剂 外周血：外周血：EDTA、肝素和、肝素和ACD均可均可 骨髓：肝素（推荐）、骨髓：肝素（推荐）、EDTA 血小板：血小板：ACD 储存时间储存时间 EDTA：2448h 肝素：肝素：4872h ACD：72h 抗体抗体 级别、克隆号、荧光素种类、级别、克隆号、荧光素种类、F/P 应尽量选用应尽量选用IVD的抗体或抗体组合的抗体或抗体组合 溶血素、破膜剂溶血素、破膜剂 膜抗原活性膜抗原活性 膜通透性膜通透性 胞内抗原与抗体结合力胞内抗原与抗体结合力 空白对照空白对照 同型对照同型对照 相同的种属来源、亚型和亚链和荧光标记相同的种属来源、亚型和亚链和荧光标记 mouse anti human IL4 (IgG1, )-FITC mouse (IgG1, )-FITC 阴性对照阴性对照 阳性对照阳性对照