细胞培养分离登革病毒.docx

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1、细由培养分离登革病毒I目的分离登革病毒。2适用箱围2.1 无菌采集发病后5日内的登革忠者血标本。2.2 经研磨处理的媒介蚊标本（参见附件II）.2.3 前准备4.1 核对被检样品：患者标本应核对患者的姓名、性别、年龄、编号及检测项目等,蚊媒标本应核对标本种类、编号、性状等。42生长状态良好的单U登革病毒敏感细胞C636,BHK2I,VERO等4.3 待测样品在检测前应放置于2-8C冰箱或置于冰上。5、操作步骤5.1 取IOp1.患者血清或蚊悬液201.用HanVS液稀按I：10稀释至OJm1.或0.2m1.备用。5.2 招在24孔细胞培养板上培养好的单层细胞上清弃抻，用Hank,s液洗涤2遍.

2、5.3 将稀释好的标本接种细胞,接种C6Z36细胞在28吸附I小时,BHK2I细胞在37吸附I小时，补加维持液至Im1.,C646细胞在28培养，BHK2I细胞在37C培养。5.4 第二天开始观察细胞病变情况,如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液01.m1.）接种细胞传代。5.4 免疫荧光法鉴定登革.病毒5.4.1 细胞抗原片的制得：出现+”细胞病变的细胞倒去维持液（若百传无细胞病变出现，仍然按此方法制备），用pH7.2PBS洗涤2次,加PBS用滴管把细胞从管壁上吹下，吹M1.o（X）转/分钟离心5分钟,弃去PBS,细胞沉淀用0.2m1.PBS吹散,滴加在抗原片上，吹干，冷内雨固定IO分钟，PBS冲洗2次,蒸饲水漂洗I次，吹干备用:5.4.2 按顺序滴加荧光标记单克隆抗体2孔，对照2孔（加PBS）,理湿盒内37水浴30分钟；5.4.3 取出，用PBS冲洗3次,蒸锚水漂洗1次，吹干:5.4.4 荧光显微镜观察结果。5.5 其他检测病毒抗原或核酸签定登革病毒参见附件2、4、5。5.6 结果判断：免疫检测有特异性黄绿色颗粒状荧光，核测出病毒NS1.抗原或病毒核酸可确定病毒分离成功.5.7 意义：从病人血清或蚊媒中分离出登革病毒，可确诊登革感染。6废弃物处理所有实脸用品都应严格按照有关传染病处理方法高压处理。