ES细胞培养.docx

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1、ES细胞培HAFBS的灭活与分装1 .化冻将血清（FetalBovineSerum.Hyclone）从-20C冰箱取出,放于4.C冰箱化冻过夜：也可空温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不立刻灭活，可以放入4C冰箱短初保存：2.火活（1） 放入室温的水浴锅内起先加热（同时放入一个内装200ml自来水的血消融,插入一根温度计，谓度监控以此为准）：（2） 当温度计显示56C时，限制在此温度30分钟3分钟；若不当心使温度上升超过56。则：若仍未超过60,且时间很短（比如:不超过5分钟）,则仍UJ运用：若超过60,或者时间较长,则弃去不用,或者尝试用于ME细胞的培育：（2）取出，自然冷却至室温（约需13

2、小时），可分奘或一2（C接岔冻存：3.分装（1）转入细胞间,用移液器将血清分装,留强预先要将血清粕轻摇动数周、混匀；吹出血清时要留意：不要吹出气泡（血清根拈树.很简单产生气泡:假如已产生气泡,则在泗林灯火焰上过一下）：标好批号和日期：（2）放入一20C冰箱冻存（分装一次大约可以运用12个月），B.配制DMEM血清培育基1 .提前一天将分奘好的FBS从20C冰箱取出.放于4C冰箱化冻：2 .在细胞间中将FBS以及其它须要添加的成分!l,丙削酸钠、抗生素等），根据比例加入DMEM培育地中，作好标签：放入4C冰箱保存。配制比例如下：SOml体枳的干细胞培育液配制DMEM(Highglucose)/D

3、MEM培百基(高柳SOuI非必制氨基酸SOOuI丙阳酸钠SOOuIB筑域乙静双抗SOuI血清7.5ml1.IFC.原代胚胎成纤维细炮（ME）的制招1 .收孕鼠,阍颈处死：2 .将翻腹面对上放置,70%酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬,污染内脏及子宫），第开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔殂织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无曲IOcm平皿中；3 .把平皿转入超净分：4 .用出干打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盆等分别，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏,肺姓、心脏和肠丹等）；5 .将国胜移入另一新的无曲皿,用PBS洗三次：6 .弃去PBS.用弯头剪将取胚剪碎,加入PBS洗

4、至溶液基本无色（14次）：7 .加入适量TryPSin-EDTA（0.25%Gibco25S20,下问），体积约等于组织块体枳：&用酒管轻轻吹匀，室温下消化1一10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体枳塔什基，轻轻吹打混匀（510次），静置；9 .沉降后符上部溶液轻轻吸出.转入肉心管中.10 .物细胞抵液管离心（100O转5分钟）：11 .奔去上消,向沉淀中加入一向培淀基,轻轻吹打上悬,将其分种至IOCm细胞培育皿,补加适量培ff基,作标签（ME-0；帝息：若冻存，则可以运用反苏后的0代ME制作Feeder；若干脆运用则最好不用0代ME细胞心Feeder,要传到代以后再用来制作Fee

5、der比较好）.转入培百箱培育：12度细胞生长状况换液（般3天换液一次），若细胞已长演i，则徐存，或者1；3-5传代（视细胞疏密而定），放入培育箱接着培育（此后不用再换液）：1一5代的ME细恂均可用求制作Feeder.饲养层细胞（Feeder）的制备注：含10ug/ml丝裂律素C的DMEM血清培方基（FBS占10%）（试脸室所用MMC为10mgm1.Calbiochem1 .弃去细胞培育皿中的培育液，加入适属含iugml丝裂毒素C的培育基8MEM+10%FBS）:2 .放入培科箱培育3小时（24小时）：3 .用0l%明股处理培方皿（将明收加入，描动使明胶覆旗全部皿底,然后吸出明胶弃去即可.室溟

6、放性2小时以上,至皿底明股干燥为1匕4 .弃去含育丝裂醇素C的培育基,加入2-3mlPBS.轻轻摇动,弃去PBS,如此洗3-5次（必需洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂毒素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）：24.加入适入胰量消化30秒,吸去消化液,静置至细胞层出现裂化或明显滑壁为止,加入培丙基，吹打.种至明股处埋过的培育皿中即可（如细胞过稀.可再补加丝裂毒素处理过的细咆），半小时后即可运用（假如急用，则可以用ES细胞培育法终止消化，然后与ES细胞一起杼入明胶处理过的新板上），可运用610天，用前更换培方液（如未用明胶处理培Ief皿则雷在培育箱中放置2小时以上方可运用：最好是前

7、一天下午制作Feeder,其次天上午运用，这时的Feeder状态最好，坡适于ES细胞贴壁生长，而旦万一制作的Feeder在其次天早上发觉出了问题，ES细胞培仔基还可以抓紧补做3DMEM+ISOS2-硫基乙醉:5.SuMI-谷氨惟胺：2mM1.IF：1000Um1.非必需氨基酸：100UM双抗：10Gibco21985-023100XSmaG8S40100ChemiconESGRO(1.IF);10E7units.货号:ESGIlO7100XGibco11140-0S0100XGibco1S070-063ES细胞的更苏1 .提前制备好相应数盘的Feeder：2 .打算3739人的热水,从液氮攥中

8、取出所需冻存管（冰存细胞），快速投入热水中，快速猿烈妮动直至冻存液全部溶化；3 .转入无剧间,WOo转/分钟离心510分钟14弃上清.加入ImlES培育液轻轻吹打力悬,转入健有饲养层细胞的培育皿中（冻存的细胞来自多大的培育皿,复苏时就刖相应大小的培育皿），补加适Jlt培育液：5.转入培田箱培育，次I换液：此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长状况.ES细胞的换液1 .提前半小时左右将培科叫从4C冰箱取出，放于室温（或者放于37C温箱内：2 .细恂培ffm从培育箱内取出，相差皿做镜卜作常规视察（推断牛.长状况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内：3 .将ES细胞培百皿内的液体吸出、

9、弃去，换程新培育基（6Cm培百皿约5ml.3.Scm培公皿约3ml培刊堪；若死细胞较多则可以先用PBS洗次，再加培H肥）；4 .放1可培行箱按著培行，ES细胞的传代1 .前一天下午做好所需数崎的Feeder细胞板：2 .提前半小时左灯将培行基从4C冰箱取出，放于室温（或者放于37C汨箱内：3 .将ES细胞培育皿、Feeder细胞培育皿从培育箱内取出相差显微饿下作常规视察，Feeder细胞应生长!好，细胞/盅95%左右,至少90%以上的培育皿面积）：ES细胞应生长良好.接近长满培育皿，细胞集落大小一样、疏密匀称，集落形态规则、呈椭阴形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致带、核大、脆质少：4 .将ES

10、细胞培育皿内的液体吸出、弃去,用PBSlm1.左右洗一遍,加入胰蛋白陆溶液.作用约30秒，当心吸出胰蛋白酶溶液.弃去：再作用15分仲，时常视察,待细胞层（皿底一层白色脏东西样脱）出现裂维井明显起先下滑时，补加培田茶，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的人的细胞团块为止；平均分到FeCder培育皿中（滴加，以免将Feeder细版吹脱落下来）.滴加补加培育基至5ml左右（滴加.以免符Feeder细胞吹脱落下来：若为3.5Cm培育皿，则补加至3ml左右，作好标签：5 .前后左右水平晃动培育皿，使ES细胤匀称分布于培HnlI中，放入培育箱接着培H，ES细胞的冻存1. 常规方法将细胞消化成单细胞处液：2. 转入试管，100o转/分钟离心5分钟：3. 配造量冰存液（为含10%二甲亚IMDMSO）,10%FBS的DMEM培育液）；4. 弃上清.秘管加入InlI冻存液.吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成35个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签：5. 放入理序冻存盒内24小时后转入液氯5中冻存。