DNA电泳实验报告杨家庆.docx

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1、浙江农林高校试验室开放项目DNA和蛋白质的电泳技术姓名：杨家庆班级：测绘工程151班学号：201518080113指导老师：杨仙玉完成时间：2016年11月23日一、试验名称：DNA的电泳技术二、试验目的：琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的运用技术，驾驭有关的技术和识读电泳图谱的方法。三、试验原理：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分别、鉴定DNA、KNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分别混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在肯定的也场强度下，DNA分子的迁移速度

2、取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。四、试验器材：仪器：制胶模具、电泳槽、电泳仪、烧杯、锥形瓶、移液枪、手套、微波炉、凝胶成像仪、分析天平、钥匙、离心机、紫外线透射仪、干式恒温器等。试剂：琼脂糖（白色粉末）、TAE缓冲液、EB（溟化乙锭-致癌剂，操作中要严格戴手套）；五、试验步骤：（一）DNA电泳试验1 .模板胶的制作： .称取Ig琼脂糖加入盛有100m1.的1*TE溶液中，混合匀称后用微波炉加热至沸腾，加热2-3次，每次沸腾之后取出摇匀，直至混合匀称； .待溶液冷却至40-50C时，倒入制胶模

3、具内（留意要快速倒入,以防倒入的过程中溶液凝胶），凝固后，上DNA样品； .上样后,将模具移入电泳槽,将样品端上到负极,通电,恒压120V,25-30min: .将胶移入凝胶成像仪，用紫外光视察，拍照存档，保存图片； .清理试验相关物品，整理试验器材，试验结束。2 .DNA凝胶回收： .称量凝胶重量，按质量：体积=1:1换算，再按凝胶：BufferG=I:3加入3倍的BufferG溶液放入干湿恒温机中加热溶化； .将溶液转入2ml离心管中，离心30s（13200rmpmin）; .在离心管中再加入500微升的BUfferNS溶液，离心30s； .加入700微升的WG溶液，离心30s： .离心结

4、束后，倒掉废液,将空的离心管放入离心机空转30s或Imin,将DN中的残留液体甩干净： .离心结束后，将含有D、A的薄片快速取出（为防止剩余的酒精再次挥发进入）： .在放置DNA薄片的离心管中加入20微升的水（水要从中间加入，打在DNA薄片上,待DNA溶于水）,静置Imin,离心： .清理试验相关物品，整理试验器材，试验结束。3 .凝胶回收后DNA片段的电泳： .将胶从凝胶成像仪中取出，在相对黑暗的条件下用紫外光照耀，看到清楚地六条条带之后，将相应的条带逐条切下（切的时候尽可能薄，每个条带的重量不要超过O.3g）,做凝胶回收，得到相应的INA分子： .重夏制胶过程，在得到的模具中市复上样过程，

5、在第一个孔内上标准DNA样品，其余孔内加入相应波长DNA样品： .上样后,将模具移入电泳槽,将样品端上到负极,通电,恒压120V,25-3Omi11: .将胶移入凝胶成像仪，用紫外光视察，拍照存档，保存图片； .清理试脸相关物品，整理试验器材，试验结束。（二）PCR（POIymCraSechainreact.ion,聚合酶链式反应）试验：1、配置反应所需试剂：反应体系为20微升，首先加入14微升水,然后依次加入2微升10*B（buffer）.0.8微升DNTPS（四种脱氧核昔酸混合物）、1微升CDNA（模板DNA）、1微升引物1、1微升引物2（用物1、2方向相反）、以及0.2微升Taq（DNA

6、聚合前”2、溶液配置好之后，对溶液溶液进行预变性处理，条件95,时间2-5min;3、预处理过后，进行变性操作，条件94C,时间30s,之后，进行退活，条件58C时间30s,然后延长反应，72C、30s；4、重复步骤3,共循环35次：5、循环过程结束，在72C下保存8min：6、制作琼脂糖凝胶，将样品与5微升IOadingbuffer溶液混合，上样，进行电泳；7、将胶移入凝胶成像仪，用紫外光视察，拍照存档，保存图片：8、清理试验相关物品，整理试验器材，试验结束。六、试验结果:标准INA上样后成像为（如下左图）：从上到下六条分带分别代表不同大小的DNA分子片段，带的粗细表现该片段的含量的多少，如

7、图,从上到下每个条带一次对应的DNA分子片段的大小为:2000bp、100Obpx750bp.500bp.250bp.100bpe凝胶回收后,各个不同片段的条带与MARKER带的对比成像为（如下右图），其中，最亮的条带对应的DN量是150ng,其余的均为50ngPCR试验结果成图为七、结果探讨：影响试验结果的因素有：1 .试验过程中仪器操作不当；2 .试验过程中液体漏加或加错:3 .电泳时电场强度以及电泳液的导电性能的影响；4 .试验中所需溶液不同浓度所带来的影响：5 .上样时在注入样品的过程中没有胜利注入；6 .凝胶成像仪运用不当等。八、试验感想和建议：1.通过一学期的试验，我更加的明白试验

8、操作对于结果的重要性。试验操作可以说是试验胜利与否的关键部分，可是马虎不得。对于须要团队合作的试验，个人认为要有强势的人员搭档，不说是精通试验操作规程，最少也得知道试验的基本操作，驾驭要做试验的操作方法，这对于后续的试验无疑是与确定性作用的。对于个人的试验实力，关键还是要看平常的积累，有些试验操作繁琐困难，须要极大的耐性，这些都应当是渐渐培育起来的。2 .通过这次试验的学习，使我学到了不少好用的学问，更重要的是，做试验的过程,思索问题的方法,这与做其他的试验是通用的，加强了我的动手实力，并且培育了我的独立思索实力，使我受益匪浅.3 .通过这次试验的学习，我学到了许多，得到了许多，有些是书本上学

9、不到的，只有自己参加了，操作了，才会知道。也要感谢老师对我们的照看。蛋白质的电泳试验一、试验名称：蛋白质的电泳技术（SDS-PAGE电泳）二、试验目的：学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE）测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。三、试验原理：蛋白质是两性电解质，在肯定的Pl1条件下解离而带电荷。当溶液的PH大于蛋白质的等电点（PI）时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的川小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形态、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由肯定量的丙烯酰胺和双丙

10、烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本试验采纳不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分广量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动：当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶（浓缩胶）和下层胶（分别胶）时，采纳两种缓冲体系：上层胶pll=6.76.8,卜层胶pll=8.9:Tris-HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性

11、及pH,是缓冲配对离子;Cl-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly为跟随离子，而在pH=8.9时,Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分别胶之间pH的不连续性，限制了慢离子的解离度，进而达到限制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分别胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分别。假如在聚丙烯酰胺凝胶中加入肯定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特殊是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键

12、被还原,肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快：反之，愈慢CSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般试验室常用的测定蛋白质分子量的方法。四、试验器材：仪器：SDS-PAGE制胶玻璃板、电泳槽、电泳仪、烧杯、移液枪、F套、微波炉、凝胶成像仪、紫外线透射仪、干式恒温器、磁力搅拌机、磁力搅拌棒等试剂：1.5MTriS-HC1.(PH=8.8).1.0MTri

13、S-HC1.(PH=6.8)、10%SDS.IOMPS、TEMED溶液、水五、试验步骤：（一）分别胶的制备：1 .将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂宜卡在架子上（操作时要使两玻璃板对齐以免漏胶）,再注入入少量琼脂，将其放入恒温振荡器中预热（预热是为了防止因室内温度过低而导致琼脂凝固：加入琼脂是为了防止胶渗漏）；2 .配置分别胶溶液，根据置.6ml水、1.3ml1.5VTris-HCl（PH=8.8）、2mlaa（acrylaimde30%）、0.05mll0%SDS的量以及依次配置溶液,并在配置过程中放入磁力搅拌机不停搅拌是混合匀称：3 .待玻璃板预热完毕，取出玻璃板，再向溶液中加入0.05m

14、ll0%APS（过硫酸筱，催化剂）以及0.02mlTEMED原液（催化剂），加好后,尽快地倒入玻璃板制胶模具中；4 .注入约一半分别胶之后，用蒸储水注满玻璃板，液封后凝胶更快,静置待其凝胶，若渗漏严峻，则需重新制胶。（二）浓缩胶制作1.配置分别胶溶液，根据:1.4ml水、0.25ml1.OMTris-HCl（PH=6.8）、0.33mlaa（acrylaimde30%）、0.O2mllO%SDS的量以及依次配置溶液，并在配置过程中放入磁力搅拌机不停搅拌是混合匀称：2 .待分别胶凝胶胜利后，倒掉上方蒸饰水，此时，再向浓缩胶溶液中加入0.02mll0%APS（过硫酸筱，催化剂）以及0.002mIT

15、EMED原液（催化剂），加好后，尽快地倒入玻璃板制胶模具中：3 .注入浓缩胶至注满玻璃板后，插好梳子，等待凝胶。（三）蛋白质电泳1 .静置30分钟左右，待凝胶结束后，拔出梳子，在孔内加入maker样品：加样时，用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽，插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上，外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可，留意避开在电泳槽内出现气泡；2 .加样后，通电，在恒流状态下进行电泳，时间90min：3 .电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，得到成胶；4 .将胶体放入清水溶液中，用微波炉加热IOS左右至温热，放入摇床脱色Iomin,重熨此过程3次，过程中要不断换水，直至背景透亮蛋白质带清楚为止。5 .清理试验相关物品，整理试验器材，试验结束。六、试验结果：蛋白质电泳SDS-PAGE电泳试验拍照结果为：其中，12%SDS-PAGE各个条带相对应的蛋白质分子量从上到下应依次为:116kDx66.2kD、45.OkD.35.OkD,25.OkD、18.4kD.14.4kD七、结果探讨：1、在第一次试验中，制作分别胶