猪病毒性腹泻灭活疫苗对仔猪保护力研究.docx

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1、摘要：PEDV引起的产房仔猪腹泻是目酋危害养猫业的主要：.大传染病(ASF、PRRS.PEO)之给养猪业造成巨大的羟济损失，疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段.为了提高疫曲的保护效果.本研究小组对PEDV段曲在病毒含册、佐剂等方面进行了大幅改进.本文总结了改迸后的疫苗免疫怀孕母猪，初生仔猪从母猪乳汁获得鼓动保护的研究结果，表明该授苗为产房仔猪PED的防控提供了更有效的措脩.关便询：PED；PEDV；疫苗自2011年底，山猪流行性腹泻病毒(porcinediarrheavirus,PEDV)GH群引起的猪流行性腹沟(PED)在我国河南然发以来，PEDVGH快速爬延至全国各大小猪场，目前已成为危

2、害养猪业的三大传染病(ASF、PRRS、PED)之一.该病主要危害新生仔猪，临床表现为呕吐、水样泻、脱水、消瘦、死亡，以7口龄内仔猪发病最为严重，发病率与死亡率可高达100%.生长育肥猪感染后偶有发病.死亡率低，但可能长期持毒，是猪场发病的病毒来源之一。对于PED的防控，疫苗免疫是比较经济实惠的手段.猪流行性腹泻病毒属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒屈(coronavirus).核酸为线性单股正链RW,基因组约为28kb.病声粒子大小约为90-195tun.PEDV基因组编码的结构蛋白包括纤突蛋白(三),小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N).纤突击门(三)为主要的免

3、疫原性击口，能诱导高水平的保护性抗体。为了给客户提供更加安全高效的产品，本研究小组坚持持续对猪病毒性腹泻灭活投苗产品进行改进升级.目前通过提升抗原含量、保存抗膜完整免疫原性及优化佐剂等，并评价其对仔猪的保护效力，结果表明我免按效力显著提升,表明大华农公司将为客户提供更加优质的产品.1材料与方法1.1 试验材料D疫苗：竞品1与竞品2是从市场购买的同类产品：止泻成I、止泻成2由广东温氏大华农生物科技有限公司提供。2）细胞及主要试剂：YerO细胞为本实验室保存，DNEM培养菜、胰蛋白前和粉牛血清公司为GibCo产品。3）试剂盒：1RA试剂盒为IDEXX产品。4）实验动物：怀孕70日龄一胎母猪（二元杂

4、），从新兴某种猪场购得.5）攻毒毒株：町毒株，P5代，由广东温氏大华农生物科技有限公司提供.1.2 雌1）试验分班：试援分组与免段方案如表1。表1母猪分组及免疫方案组别、免疫方案免疫剂量数量怀孕91日怀孕105日A止泻威1止泻威12m1.次5B止泻威2止泻威22m1.次5C竞品1竞品14m1.4D竞品2竞品24m1.饮4E对照对照不免疫42）攻毒方案：对止百威1、竞品1、竞品2免我阻及对照组所产57日龄哺乳仔猪进行攻毒.攻毒剂值为105.0TeID50/头，攻毒方式为口服.3中和试验：牛.长良好的VCro细胞用胰蛋白的消化，用DMEM生长液分散后，稀释至58X10个m1.,垃后将细鼬加入96孔

5、板中,O.Iml./孔，96孔板置于37C、5%CO）培养:侍96孔板中YerO细胞生长至致密，用DMEM培养液洗涤细胞3次,200l孔/次,最后加入合适At胰蛋白IDMEM培养液，100P1./孔:用DMEM2倍系列稀择血清或乳汁至210,分别取100U1.与100H1.病再液（1000TClD111.）混合，置于37C5SC0,孵育1h,每个稀C度电复4次:去除步骤中96孔板中培养液,每孔加入200u1.血清或乳汁稀和液与病毒混合液，汉37也、5%CO；源Fflh后,弃除,用DMEN培养液洗涤细胞3次，2001.孔/次，最后加入含适量胰蛋白ISDMEM培养液，2（WU1./孔，置于37匕、

6、5%C（X培养57d；同时设病声对照和阴性血清对照：每日观察细胞病变效应CPE）：50%血清中和终点的计算：50%细胞不产牛.细胞病变（CPE）的血清稀移度.根据细胞病变程度，用Keed-Muench法计算50血清中和滴度.4）抗体检测：1RG抗体与IgA抗体检测按照试剂盒说明书进行。2结果2.1 抗体检费结果血清中和抗体水平图I母猪血清中和抗体水平1）血清中和抗体：该批母猪为一胎母猪,免疫前抗体小部分母猪为阳性（见图I中免我前中和抗体结果），将母猪l机分组迸行2次免疫后，在二免后2周，从桃导血清中和抗体水平（见图2来看,止泻威诱导中和抗体高于400,最中达512,且禹力度低（小于IOIO,显

7、著优于同时对比的两个竞M,.初乳SlgA抗体水平图2初乳中SIgA抗体水平2）初乳中SIgA抗体:采集产仔当天的乳汁（初乳），用IDEXX试剂盒检测其中的SIgR抗体,从检测结果（见图2）可以看出.止泻成诱导了高水平SlgA抗体,显著高于两个竞马，3）初乳中和抗体：通过检测初乳中和抗体（见图3）发现，止汨威免疫后诱导的中和抗体平均值达100母上，股高可达512,显著高于两个竞品.初乳中和抗体水平600止泻威1止泻威2克品1图3初乳中和抗体水平2.2 乳仔猪被动保护在仔猪哺乳57d,采用野毒町株对其诳行攻击，每头仔猪口眼10TClDae在攻毒后2448h,对照组、竞品1组、竞品2组仔猪均出现不同

8、程度呕吐、眼泻，止泻威班在攻击后35d仅个别仔猪出现轻微I圾泻，各组仔猪腹沟率、存活率及存活弱仔率见表2,综合腹泻发病率、存活率及存活弱仔率，止泻威的保护效果显著高于两个竞品表2哺乳仔猪攻指后发病统计表组别母猪数(头)总仔猪数(头)腹泻率(%)存活率(%)存活弱仔率(%)止泻威5592485.000.竞品I4499070.5829.17竞品24489559.4640.91空白对照447148.9465.223讨论与结论目前市件的疫苗主要有猪传染性百肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹汨二联灭活疫苗两类疫苗，近几年为PED的防控做出巨大的负就,但是活疫苗免疫后能不同程度地排揖

9、排毒时间不一增加猪场环境中的病毒载量且活投苗免疫后，猪只带毒时间长，果然在配怀舍，不排毒，但进入产房后可能迅速持毒,导致初生仔猪感染发病,采用佐统工艺制备的病毒性股沟灭活投苗，抗原含地有限（10*TCIDml.）,且常用的灭活剂能一定程度地破坏抗原表位，导致免疫原性降低（数据未发表），因此，病毒性腹沟灭活疫苗的免按效力仍有提升的空间。木研究小加通过工艺改进有效提高了PEDV有效抗原含量，达200gml.,且筛选到能完整保留病而结构的灭活剂，以此制符的狡苗经本研究评估脸证，无论从二免疫后2周血清中和抗体、初乳中SIgA抗体及初乳中和抗体三项指标评价，还是从哺乳5-7d初生仔猪的攻击保护（仔猪腹沟率、存活率及存活弱仔率）评价，猪病毒性服河灭活疫苗免狡效力显著优于竞品疫苗，初生哺乳仔猪能获得更优于竞品痕苗的被动保护.