MRPS5 对膀胱癌细胞增殖能力及干性特征的影响.docx
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1、率较高,占泌尿系肿瘤近90%以上1,20其发病机制不详,可能涉及到癌基因激活和抑癌基因失活3。临床根治性膝胱切除术仍是膝胱癌治疗的主要治疗方式,但术后病人生活质量极度下降,且术后复发率高,5年生存率仅50%左右4,5,因此,发觉利于临床诊断、治疗、预后评估的分子标记显得尤为重要。机体苍老是肿瘤发生的易感因素,探讨证明长寿相关基因参加调控这种易感性,如线虫长寿相关基因Sir2、daf-2.Iin2、dct2,nnt-1等既能调控寿命,也能促进肿瘤细胞的增殖或凋亡,而它们在哺乳动物都有相应的同源基因6-9。同时肿瘤细胞线粒体DNA突变率高,诸如线粒体Cytb、ND6等基因突变甚至能促进肿瘤细胞演进
2、,因此线粒体DNA突变所致的线粒体功能障碍已成为肿瘤细胞重要特点之一10T2.最新探讨发觉线粒体核糖体蛋白S5(miIochondrialribosomalproteinS5,MRPS5)基因通过线粒体代谢机能障碍途径调控线虫及小鼠的寿命,而且MRPS5作为线粒体核糖体28S小亚基成员,与线粒体能量代谢相关,我们由此推想肿瘤中MRPS5也可能发生功能变更进而调控肿痛生物学功能。关于其在膀胱癌中的作用尚无报道,本试验将探讨其对膀胱癌细胞增殖及干性特征的影响。1 .材料与方法1.1试验材料人膀胱癌及癌旁组织由第三军医高校西南医院泌尿外科张恒收集。NOD/SCID小鼠购于重庆腌鑫生物技术公司并饲养于
3、第三军医高校西南医院试验动物中心。人膀胱癌T24细胞由我室保存。RPMI1640培育基,胎牛血清,胰醉等细胞培育相关试剂购自Gibco公司。兔抗人MRPS5,Nanog.OCt4抗体购自abeam公司,兔抗人GPDH,Sox2抗体购自CellSignaling公司,小鼠抗人C-MyC抗体购自SantaCruz公司。CellTiter-BlueCellViabilityAssay试剂盒购自PrOlnega公司。细胞周期检测试剂盒购Fl碧云天公司。分子克隆试剂及慢病毒包装质粒等主要由本室保存。BBG16UV1511.二氧化碳培育箱及CKX41-32PH倒置相差显微镜等分别购自Thermo.Olym
4、PUS公司,流式细胞仪、VarioskanFlash多功能酶标仪由第三军医高校西南医院公共试验平台供应。1.2主要方法1.2.1细胞培育T24细胞培育于10%胎牛血清RPMII640(含青、链霉素)培育基中,在温度为37C,5%CO2浓度的培育箱中孵育,细胞密度达80%-90%进行传代。试验采纳对数期长势良好的细胞。成球培育基为DMEM/F12,含20ngmlEGF、20ngmlbFGF.20mgmlB27、汽甲基纤维素。培育条件同前。1.2.2 慢病毒干扰载体感染T24细胞按分子克隆技术制备靶向干扰MRPS5的载体P1.KO.l-shMRPS5及比照载体P1.KO.1-shScramble,
5、进行慢病毒包装后收集病毒液分装储存于-80,Co细胞分为P1.KO.l-shMRPS5试验组及P1.KO.1-shScramble比照组。感染前细胞接种于六孔板内,待融合度达40$时分别加病毒液感染16小时,再换液后接着培育。1.2.3 WesternBlot病毒感染72小时后裂解细胞提取总蛋白,煮沸变性后行SDS-PAGE电泳,湿转到NC膜,5%脱脂牛奶室温封闭2小时后,一抗4度过夜,PBST洗涤,二抗室温孵育1小时,PBST洗涤后显影拍照。MRPS5表达用于检测病毒干扰效率。NanOg、OCt4、C-Vyc、Sox2抗体用于反映肿瘤干性转录因子13,14的表达。人膝胱癌及痛旁组织经裂解后检
6、测MRPS5的差异表达。GAPDH作为内参。结果重熨3次。1.2.4 细胞增殖实力检测分别收集感染近60小时的T24细胞,流式细胞仪计数(解除7-AAD阳性死细胞)后铺96孔板。每孔100Ul培育基,各含100O个活细胞。铺板后其次天起检测细胞活力(计为第1天)。根据CellTiter-BlueCellViabilityAssay试剂说明操作。试验重复3次。1.2.5 细胞周期检测分别收集病毒感染72小时的细胞,PBS洗,70%乙醉4度固定过夜,根据周期检测试剂说明行PI染色后流式488nm波长检测。试验重曳3次。1.2.6 成球试脸感染72小时的T24细胞,经流式细胞仪计数(解除7-D阳性的
7、死细胞)后铺超低黏附96孔板。每孔100Ul成球培育基,含10个活细胞,各铺10个复孔。静置培育14天后倒置显微镜下视察成球率(每孔细胞球数目总和/每孔加入的细胞数100%)及直径,并拍照。1.2.7 小鼠体内成瘤试验10只5周龄雄性M)D/SCID小鼠,体重约16gT8g,随机均分为P1.KO.l-shMRPS5试验组及P1.KO.1-shScramble比照组。将分别经病毒感染72小时后的T24细胞传代扩大培育后,分别用无菌PBS制成单细胞悬液并计数。试验组每只小鼠双侧背部皮下各注射5106试验组细胞,比照组则注射相同数目比照组细胞。待小鼠皮下成瘤后每2天记录移植瘤体积(肿瘤体积=短径长径
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