Luteolin对实验性胰腺炎的保护作用.docx

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1、本探讨通过视察1.ut对雨蛙素联合脂多糖诱导的小鼠重症急性胰腺炎组织病理、生化指标、促炎及抗炎因子表达水平、血红素加氧丽(HemeOxygcnase-IHO-1)表达水平以及核因子kappaBp65(nuclearfactorkappaB,NF-Bp65)的影响，初步探讨1.ut对小鼠重症急性胰腺炎的爱护作用及其可能机制。1材料与方法1.1材料与试剂65健康雄性C57B1./6小鼠50只，体重20-22g,购自中科院上海试验动物中心。1.ut购自上海同田生物科技有限公司，雨蛙素(CerUlein,Cn)和脂多糖(IiPoPolySaCCharide,1.PS)均购自美国Sigma公司。血淀粉随

2、试剂盒、丙二醛(VDA)试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建生生物制品探讨所。HO-KTM-、I1.-IOE1.ISA试剂盒均购自美国RD公司。Trizoi试剂购自美国Invitrogcn公司，逆转录试剂盒、realtime-PCR试剂盒均购自日本Tankara70公司。兔抗鼠Ho-1、TNF-、I1.-10、NF-RP65、均购自美国SantHcruz公司。内参抗体-actin、1.aminB及羊抗兔荧光标记二抗均购自巴傲德生物公司。方法动物分组及模型制作1.21.2.1根据随机安排原则将小鼠分为5组，即生理盐水组(WrmalSaline,NS)、模型组、低剂量751.ut给药组

3、、中剂量1.ut给药组和高剂量1.ut给药组，每组10只。心粒细胞和单核细胞浸润。胰腺间质内动脉痉挛，静脉明显扩张淤血，炎性细胞附边，局部血管出血、坏死（图Ib）；低、中、高1.Ut给药组相比模型组有不同程度的水肿、浸润及坏死程度的减轻（图1c、Id、le）O各组评分结果见表2o表2Schmidts胰腺组织病理评分结果Table2Theresultsofpancreatichistopathologyscore病理变更NS组间质水肿炎症浸润实质坏死实质出血SAP模型组间质水肿炎症浸润实质坏死实质出血低1.ut给药组间质水肿炎症浸润实质坏死实质出血中1.ut给药组间质水肿炎症浸润实质坏死实质出血

4、高1.ut给药组间质水肿炎症浸润实质坏死实质出血分值0123总数9100101000010100001010000100046IOa0046IOa0037IOa0640IOa0244IOab0253IOab0253IOac262IOab05321Oac0622IOac0451IOac7300IOacPmode1group;C：lowdose1.uteolingroup;D：middledose1.uteolingroup;E：highdose1.uteolingroup1301352.2各组胰腺组织湿重比及Mf)A.MPO含量测定结果如表3所示，与生理盐水组相比，模型组胰腺湿重比、MDA含量以

5、及MPO含量均显著增高(PV0.05),低、中、高1.ut给药组相比模型组三项指标均有不同程度的下降(P0.05或P0.01)o表3各组胰腺组织湖重比、MDA含量及MPO含量Table3Thepancreasweight/bodyweight、MDAandMPOlevelinpancreasIissure胰腺湿重比(mg/g)64.870.251.721.240.100.0469.240.48a7.342.16a0.670.10aabab140组别例数MD含量(nmol/mg.prot)MPO含量(Umg)NS组SAP模型组低1.UI给药组中1.ut给药组高1.Ut给药组注：a：与生理盐水组相

6、比PV0.05：b：与模型组相比P0.05；c：与模型组相比P0.01各组血清淀粉酶、HO-RTNF-.I1.-IO值测定结果2.3如表4所示，与生理盐水组相比，模型组血清淀粉酶、TNF-水平显著增高(PV0.05)，145150TNF-mRNA水平增高倍数(PV0.05或P1551600.01)。模型组HO-ImRNA.I1.-IOmRNA水平较生理盐水组已有小幅度增高，低、中、高1.Ut各给药组可使HO-IInRA、I1.-IOmRNA水平增高幅度更为明显(P0.05或PV0.01)O图2各组胰腺组织IIO-I,TNF-I1.-IOmRNA水平表达状况。表与模型组相比，p.05；Figur

7、e2ThemRNAlevelofHO-1,TNF-,I1.-IOinpancreastissureamongeachgroup,ap.01vs.NSgroup；bp.05vs.APgroup；2.5各组胰腺组织HOT、TNF-,I1.-10.NF-Bp65蛋白水平表达结果a代表与生理盐水组相比，p.05：c代表与模型组相比，p.01b代cp.01vs.APgroup165如图3所示，与生理盐水组相比，模型组TNF-、NF-Bp65蛋白表达水平显著上升(PV005),低、中、高给药组可不同程度降低TNF-、NF-BP65蛋白表达水平(PCO.05或PV0.01)。模型组HO-KI1.-IO蛋白表

8、达水平较生理盐水组已有小幅度上升(P0.05),低、中、高1.ut给药组可使HO-UI1.-IO蛋白表达水平增高幅度更为明显(P0.05或PV0.01)o图3各组胰腺组织HO-KTNF-.I1.-IO及NF-B蛋白表达状况。A：各组胰腺组织HO-KTNF-I1.-IO及NF-B蛋白表达变更:B-E：各组胰腺组织HOT、TNF-.I1.-IO及NF-B蛋白相对表达量的变更。Figure3.TheproteinlevelsofHO-I,TNF-fI1.-10,NF-Binpancreastissureamongeachgroup.A：ChangesofHOT、TNF-、I1.10andNF-Bex

9、pressionatproteinlevelamongeachgroup；B-E：RelativeexpressionlevelofHOT、TNF-、I1.10andNF-Bamongeachgroup,ap.01vs.NSgroup；bp.05vs.APgroup：-6-170175a代表与生理盐水组相比，p.05；b代表与模型组相比，p.05；C代表与模型组相比，p.01cp.01vs.Pgroup。3探讨在SAP的发病过程中，早期胰蛋臼酶原被激活转化为.胰蛋白酶，诱发局部炎症反应，180185190195200205210215炎性介质产生，多核中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞释放溶酶体酶

10、、氧自由基(OXygCnfreeradicals,OFR),血管活性物质和促炎反应介质6OFR及其衍生物作为分子起源在胰腺损害的过程中起重要作用，这些高度的活化物质可通过脂肪酸过氧化作用造成的类脂膜破坏及溶腑体膜破坏。此外OFR可激活补体，促进白细胞黏附、活化和迁移，能够损伤内皮细胞的完整性，增加毛细血管的通透性，造成循环血量的丢失，引起微循环障碍，加重胰腺损伤7-9HO-I也被称为热休克蛋白-32(HSP-32),为一种应激诱导蛋白，是降解血红素为胆绿素、一氧化碳(CO)和亚铁的限速酹。近来探讨显示，应激状态下，HO-I通过抗氧化、维持微循环正常功能和抗炎性介质反应等机制爱护细胞。急性胰腺炎

11、一旦发生即可引起氧化应激反应基因的剧烈上调，尤其是HO-I基因显著上调最为显著。这表明机体具有对抗应激的代偿机制，然而胰腺的局部病变并未因此停止，缘由在于对抗炎性介质反应的应激基因表达难以拮抗和抑制大量释放的促炎细胞因子基因表达13。1.Ut作为一种Iii然抗氧化剂，已被多种体内外试验证明具有上调HO-I表达水平的功能14。本试验通过口服不剂量的1.ut进而不同程度地提高了机体HO-I表达水平，1.ut给药组可呈剂量依靠性地显示出对小鼠SAP的爱护作用，主要表现为血清淀粉酶水平的降低，胰腺组织病理评分的降低以及胰腺湿重比的下降。MD是氧自由基引起细胞脂质过氧化的产物，而过氧化脂质是自由基与脂质

12、作用的产物，可间接映机体细胞受氧自由基攻击的严峻程度。MPO作为衡量中性粒细胞浸润程度的指标，SAP时胰腺组织含量显著增高，提示中性粒细胞浸润增多。本试验结果显示，1.ut给药组可呈剂量依靠性地降低胰腺组织MD和MPO含量，提示1.ut能够在有效改善胰腺组织的抗氧化实力并减轻机体脂质过氧化程度的同时削减胰腺组织中性粒细胞的浸润，发挥对胰腺炎的爱护作用。在SAP的炎症应答过程中，致炎因子和氧化应激产物发挥协同作用，触发共同的信号传导通路，主要通过NF-B的激活，导致了炎症因子的级联犷增。NF-B是以同或异二聚体形式存在的核转录因子。通常，非激活状态下，NF-B二聚体与其抑制蛋白IB非共价结合于胞

13、浆内以无活性形式存在。很多因素通过激活一个或数个信号转导途径，导致IKB磷酸化、IB快速泛素化，从NF-B/IB复合体中释出。NF-B活化并向核内转移，其活化形式是P65和P50组成的异二聚体15。NF-B的激活可促进TNF-的释放，而TNF-的大量释放乂促进IB的磷酸化使NF-B进一步激活，导致最初的炎症信号不断放大，这是一类正反馈。TNF-是SAP早期转录水平增加较早的炎症因子，其上升可诱导I1.-6、I1.-8及其自身表达的增高，从而引起级联反应，造成炎性介质的失控性释放16o此外TNF-还能促进炎症部位臼细胞聚集和活化，活化的白细胞又可产生大量OFRo因此，致炎因子特殊是TNF-和氧化

14、应激的相互作用形成了一个恶性循环，是导致SAP的重要根源6,17,18o目前探讨表明，抑制氧化应激可抑制NF-B活性，显著削减TNF-等炎症因子的合成和释放，延缓缓急慢性炎症的发展19。I1.-IO作为体内一种重要的抗炎因子，其可抑制TNF-,I1.-2、I1.-3等细胞因子的合成并可负反馈抑制NF-B的激活，对SAP所致多器官损伤有爱护作用，在SAP早期机体起先释放TNF-等促炎因子导致疾病恶化的同时，机体也起先释放I1.To等抗炎细胞因子，但仍难以阻挡全身过度炎性介质反应和胰腺坏死。提高SAP状态下抗炎细胞因子I1.TO表达和抑制促炎细胞因子TNF-表达可缓解或阻断胰腺的局部病变和SAP-

15、7-所致的多器官功能衰竭20,21。本探讨显示，口服赐予不同剂量1.Ut致机体HO-I水平剂量依赖性高表达时，血清和胰腺组织中的H.T0含量也呈剂量依匏性增高，而NF-B,TNF-表220达水平却相应地降低。由此推论,可能是HO-I提高I1.-IO表达抑制TNF-的释放或者通过抑制NF-B的活化进而抑制TNF-的释放。总之，木探讨证明1.ut对SAP小鼠模型的爱护作用，其部分机制可能与1.ut增高组织HO-I活力，降低氧化应激水平、削减中心粒细胞浸润、促进抗炎因子I1.-IO的表达及抑制NF-B.TNF-表达有关。尽管如此，1.ut对SAP的爱护作用仍需进一步的理论与临床论证。225参考文献(ReferenCeS)11.opezMartinA,Carri1IoAlcarazA.OxidativestressandacutePanCreaIitiSJ.RevEspEnfermDig2011;103:559-62.2Apodaca-TorrezFR,1.oboEJ,Montciro1.M,deMeloGR1GoldenbcrgA,HeraniFilhoB,Trivi