GH-T1452-2024蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定 液相色谱-串联质谱法.docx

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1、ICS67.180.10CCSX31GH中华人民共和国供销合作行业标准GH/T14522024蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定液相色谱-串联质谱法Determinationoftrigonellineinhoney一liquidchromatography-tandemmassspectrometrymethod2024-03-22发布2024-09-01实施中华全国供销合作总社发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化技术委员会(SAC/TC601)归口。本文件起草单位：秦皇岛海关技术

2、中心、上海冠生园蜂制品有限公司、江苏蜂奥生物科技有限公司、喀什海关技术中心、厦门喜多多食品销售有限公司、西双版纳金棕生物科技有限公司、福建省产品质量检验研究院、中国蜂产品协会、武汉安孕堂食品技术开发有限公司。本文件主要起草人：崔宗岩、温昊松、张孙现、张琴、黄学者、贾英杰、张羽、孙国峰、李文丽、祖铁红、管志斌、许永生、李娜、贾光群、刘晓茂、张进杰。蜂蜜中葫芦巴碱含的测定液相色谱一串联质谱法1范围本文件规定了蜂蜜中葫芦巴碱含量的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅

3、该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样用0.1%甲酸溶液溶解，其中葫芦巴碱经阳离子固相萃取柱提取净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。5.1 试剂5.1.1 甲酸(CH2O2):色谱纯。5.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。5.1.3 氨水(NH3H2O)o5.1.4 乙晴(CH3CN):色谱纯。5.1.5 乙酸钺(CH3COONH4):色谱纯。5.2

4、 溶液配制5.2.10.1%甲酸溶液：取Im1.甲酸1.l)于100Om1.容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。5.2.22%氨水甲醇溶液：取2m1.氨水1.3)于100m1.容量瓶中，用甲醇1.2)定容至刻度，混匀。5.2.380%甲醇水溶液：取80m1.甲醉(5.1.2)于100m1.容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。5.2.45mmol1.乙酸铁溶液：称取0.385g乙酸铁(5.1.5)于100Om1.容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀。5.3标准品5.3.1葫芦巴碱(Trigonelline,CH7NO2,CAS号：535-83-1,纯度299%),5.3.2葫芦巴碱-ch(Trigone

5、lline-ch,C7H4D3NO2,纯度298%)。5.4标准溶液配制5.4.1葫芦巴碱标准储备液(Imgm1.):准确称取葫芦巴碱3.1)标准品IOmg(精确至0.Olmg),置于10m1.容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为Img/m1.的葫芦巴碱标准储备液，28条件下保存，有效期6个月。5.4.2葫芦巴碱-d3储备液(Imgm1.):准确称取葫芦巴碱Y3(5.3.2)标准品IOmg(精确至0.Olmg)置于IOm1.容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为Img/m1.的葫芦巴碱-d3储备液，28条件下保存。5.4.3葫芦巴碱标准中间溶液：准确移取葫芦巴

6、碱标准储备液(5.4.D100U1.,于Iom1.容量瓶中，用80%甲醇水溶液(5.2.3)稀释并定容，混匀后配制成浓度为10gIn1.的葫芦巴碱标准中间溶液，28C条件下保存，有效期3个月。5.4.4葫芦巴碱-ch中间溶液：准确移取葫芦巴碱-d3标准储备液(5.4.2)100U1.,于Iom1.容量瓶中,用80%甲醇水溶液2.3)稀释并定容，混匀后配制成浓度为IOUg/m1.的葫芦巴碱-d3中间溶液，28C条件下保存。5.4 .5葫芦巴碱标准工作溶液:分别移取葫芦巴碱标准中间溶液(5.4.3)10U1.、201.501.1001.200J5001.至10m1.容量瓶中，并分别加入1001.葫

7、芦巴碱-d3中间溶液(5.4.4),用80%甲醇水溶液(5.2.3)稀释至刻度，分别配制成浓度为0.01g/m1.、0.02g11t0.05g/m1.、0.1gm1.0.2g/m1.、05gm1.的葫芦巴碱标准工作溶液(葫芦巴碱-d3浓度均为0.1Ugm1.),用于绘制标准工作曲线。标准工作溶液现用现配。5.5 材料5.5.1强阳离子固相萃取柱：60mg3m1.,或相当者。5.5.2微孔滤膜：有机系，规格0.22mo6仪器和设备6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。6.2 分析天平：感量0.0Ig和0.00001go6.3 涡旋混合器。6.4 固相萃取装置。6.5 氮吹仪。6.6 容

8、量瓶：10矶、50m1.、100m1.、1000m1.7试样制备与保存7.1 试样的制备对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出20Og作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。7.2 试样的保存试样于常温下保存。8测定步骤8.1 提取称取蜂蜜样品2g（精确至0.0Ig）至烧杯中，加入适量0.1%甲酸溶液溶解并转移至50m1.容量瓶中，用0.1%甲酸溶液冲洗烧杯两次并转移至容量瓶中，定容，混匀。含量超出线性范围的样品需适当倍数稀释。然后取1.Om1.溶液于样品瓶中，向其中加入10P1.

9、葫芦巴碱-ch中间溶液（5.4.4）,混匀后待固相萃取净化。8.2 净化强阳离子固相萃取柱（5.5.1）依次用3m1.甲醇活化和3m1.水平衡，上述加入内标的提取液上样至固相萃取柱，依次用3m1.水和3m1.甲醇淋洗，抽干，用3m1.2%氨水甲醇溶液（5.2.2）洗脱。收集洗脱液，50条件下氮气吹干。加入80%甲醉水溶液（5.2.3）lm1.,涡旋Imin溶解残余物，微孔滤膜（5.5.2）过滤，液相色谱-串联质谱仪测定。8.3 涌定8.3.1 液相色谱参考条件a）色谱柱：HI1.IC柱（2.lmm100mm,1.7pm）,或相当者；b）流动相：A相为乙脯（5.1.4）,B相为5mmol1.乙酸

10、镀溶液（5.2.4）,梯度洗脱条件见表1;c）流速：0.3m1.min;d）柱温：40;e）进样量：21.表1梯度洗脱条件（A:乙庸；B:5mmol/1.乙酸筱溶液）时间(min)流速(m1.min)A(%)B(%)0.00.390100.50.390101.50.350503.50.350504.00.390106.00.390108.3.2质谱参考条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI）b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应监测（MRM）,葫芦巴碱和葫芦巴碱d3的MRM参数见表2;d）离子源温度：120;e）脱溶剂温度：350;f）脱溶剂气体流速：6501.h;g）毛细管电压：3kV

11、o表2葫芦巴碱及葫芦巴碱-ch的多反应监测（MRM）参数化合物名称定性离子对（11z）定量离子对（mz）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）葫芦巴碱138.0/78.0138.0/92.05022138.0/92.020葫芦巴碱-Ch141.0/97.1141.0/95.15020141.0/95.1208. 4液相色谱-串联质谱测定9. 4.1定性确证每种被测组分选择一个母离子，两个及以上子离子，在相同实验条件下，试样溶液中葫芦巴碱和葫芦巴碱-d3的保留时间与标准溶液中相应组分的保留时间一致，相对偏差在2.5%之内，所有离子对都出现，且相对离子丰度与浓度相当的标准溶液相对离子丰度一致，其允许偏差应

12、符合表3的要求。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%50%10%20%10%最大允许偏差+20%+25%30%土瓢10. 4.2定量测定按照8.3.1和8.3.2设定仪器条件，以目标物的质量浓度为横坐标，以目标物峰面积与同位素内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，按内标法计算试样中目标物的含量。标准溶液及试样溶液中的目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。11. 5平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。12. 空白试验除不称取样品外，均按上述相同条件和步骤进行。9结果计算结果按式(1)计算：y_pVfOW)m100O式中:X-试样中被测组分含量，单位为

13、毫克每千克(mgkg);p从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每亳升(Hgm1.);V样品溶液定容体积，单位为毫升(m1.);J试样溶液稀释倍数；m所称试样的质量，单位为克(g)o计算结果应扣除空白值；目标物含量210.OmgZkg时，计算结果保留3位有效数字；含量10.0mg/kg时，计算结果保留2位有效数字。10定量限本文件中葫芦巴碱的定量限为0.25mg/kgo11精密度两次平行测定的绝对差值不超过其算术平均值的10机附录A（资料性）葫芦巴碱和葫芦巴碱-d3的多反应监测（MRM）色谱图葫芦巴碱和葫芦巴碱-ch的多反应监测（MRM）色谱图见图A.1IQ2S.i=wxxS时间TWmn时间TimeZmin时间TimeZmin时间TiaeZmin图A.葫芦Bil（Q5ug梅芦BrthUQlu如）的多反应监测（M）色谱图