GB_T 43650-2024 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程.docx

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1、ICS65.020.01CCSB60中华人民共和家标准GB/T436502024野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程TechnicalproceduresforDNAspeciesidenticationofwildanimalsandtheirproducts2024-03-15发布2024-07-01实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会目次前言IIl1 范围12 规范性引用文件13 术语、定义和缩略语13.1 术语和定义13.2 缩略语24样品采集与储存21.1 样品采集21.2 抽样21.3 取样与储存21.4 运输35 DNA鉴定程序的构成46 DNA鉴定程序46.1 样品前

2、处理46.2 DNA提取56.3 DNA纯化56.4 DNA质量评估56.5 检测方法67结果表述108追溯方法109污染预防与处理1（）10实验室区域设置IO11仪器和试剂要求1012实验室清洁1013安全防护1014废弃物处理10附录A（资料性）电泳检测程序11A.1常规电泳检测法11A.2芯片电泳检测法12A.3其他电泳检测法12附录B（资料性）通用引物序列信息138.1 Cytb基因通用引物138.2 COI基因通用引物138.3 12SrRNA园回置周酶138.4 16SrRNA浸血圈周功曲13附录C（资料性）通用引物PCR反应体系与反应程序15C.1询缺窈15C.215附录D（资料

3、性）特异性PCR的引物、反应程序与反应体系16c.lSaigatatarica16C.2（Pantherauncia16C.300（Pantheraardus）的身0施17C.41（Pantheratigris）的孱固物17C.5gg铝（UrSUSIhibetanus）陶身0物17附录E（资料性）qPCR反应体系与反应程序18E.1屈庖OS18E.2底18附录F（资料性）dPCR反应体系与反应程序19F.1屈阿嗨19F.2图幅19参考文献20Il本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承

4、担识别专利的责任。本文件由国家林业和草原局提出。本文件由全国野生动物保护管理与蜂否利用标准化技术委员会(SAC/TC369)归口。本文件起草单位：东北林业大学、东北林业太学司法临定所、深圳作大生命科学研究院、中国海关科学技术研究中心、黑龙江省公安厅，峰尔滨检验检测认证集团有限公司、深圳华大法医科技有限公司、广东华大法医物证司法鉴定所，黑龙江省野生动物研究所、华南动物物种环境损害司法鉴定中心、南宁海关技术中心、南京警察学院、合肥海关技术中心、广西壮族自治区公安厅、东潭市公安易。本文件主要遵草人出素英、马跃、王震、李波、张伟、孙磊、徐艳春、张利峰、王剑刘微物天天、兰天明、Ill野生动物及其制品DN

5、A物种鉴定技术规程1范围本文件规定了对野生动物及其制品的水源进行中卜物种鉴定时样品采集与储存、DNA鉴定程序的构成、DNA鉴定程序、结果表述、追溯方法、污染预防与处理、实验室区域设置等主要技术要求。本文件适用于野生动物度其制品来源物种的DNA检验鉴定2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。具中，河日期的引用文件，仅该日期题应的最木适用于本文件，不让出期的写明文件，其报新版本（包括所有的修吸单）适用于木文件。GB1969验室生物安在西用要求GB/T194962转基因品应实验的位不要GBZE123Fl分立个样类产流随机抽植经施指南GB/TB4796水溶液币核

6、酸的在度和细度格则紫外分光光度人GA/TE83法庭科学D空检验规池1.Y/TOl野生动物及其产品的预理鉴定规范,NY/T5-216曾医诊和称品采集、保3术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用了本文件C3.1.1DNA条形码DNAbarcode选定的标准区域的、用于物种鉴定的段相对较短的保守DNA片段。3.1.2DNA物种鉴定DNAspeciesidentification利用DNA检验技术对野生动物及其制品进行分类地位（科、属、种）的判定。3.1.3序列比对alignment利用计算机算法和程序，确定两个或多个核甘酸序列的相似性以至于同源性。3.1.4引物primers人工合成

7、的两段互补寡核甘酸片段，一段与靶区域5端DNA模板链互补；另一段与靶区域3端DNA模板链互补。3.1.5荧光探针fluorescentprobe5端和3端分别标记荧光基团和淬灭基团，并与日的DNA序列碱基互补的一段DNA片段。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。BO1.D:生命条形码数据系统(barcodeoflifedatasystem)Ct值：循环阈值(CyCIeIhreShokI,或Cq值)Cytb:细胞色素b(cytochromeb)dPCR:数字PCR(digitalPCR)PCR:聚合酶链式反应(PoIymeraSechainreaction)qPCR:实时荧光定量PCR(rea

8、l-timefluorescencequantitativePCR)RF1.P;限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)4样品采集与储存4.1 样品采集4.1.1 样品分成两等份，作为检样和储存样。4.1.2 规范标记编号，记录采集时问、地点、类型等内容，保证样品可追溯。4.1.3 样品分别采集、分别包装，注意工具清洁或消毒，防止交叉污染。4.2 蝌4.2.1 形态特征完整、可分类识别的同类多个检材.，按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行。4.2.2 具有部分形态特征、可简单分类的多个检材，先分类，再按照GB/Z31

9、233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行：或按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。4.2.3 2.3不具有可识别的形态特征的大批量检材，先按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行，结果出现多个物种时，再按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。物种的个体数量可按鉴定结果所占比例核算。4.3 取样与储存4.3.1 ffi*昆虫等小型无脊椎动物可整体取样，取适量或整体粉碎，收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或一20保存。4.3.2 组织和内脏应先去除易污染的表层，宜采取新鲜洁净的组织或内脏5mm3以上，收集到离心管或密封袋等储存介质中，冷藏暂存,宜尽快在-20

10、C以下保存。4.3.3 皮张与蛇蜕等取Icm2以上收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或一20保存。4.3.4 骨骼与牙齿整体送检或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉（组织残留时宜取组织），收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或-20C保存。4.3.5 皮肤衍生物4351角、喙、爪、鳞、龟鸭整体送检或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或-20保存。43.52毛、病收集1根以上置于离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或-20C保存。注：皮肤衍生物是指由皮肤衍生而成的特殊器官，女吒、羽、喙、爪、蹄、角、鳞、鳍、盾片、骨板、龟甲等

11、。4.3.6宜选新鲜全血采集于EDTA抗凝管或采血卡。血痕宜用采样拭子等采集.抗凝管和采样拭子等冷藏或一20C保存；采血卡晾干，常温、冷藏或-20C保存。1.1.1 就用清洁容器或密封袋等收集1m1.5m1.,密封，冷藏或-20C保存。4.3.8 蜘用消毒的镜子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于0.2g,收集到离心管或密封袋等储存介质中，可加干燥剂或保存液，常温、冷藏或一20C保存。4.3.9 5MM唾液等用消毒的纱布、棉花或拭子等采集，晾干密封常温保存；或者直接密封，冷藏或一20C保存；收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中，冷藏保存，宜尽快于一20保存。注：分泌物是指由腺体和的i

12、器官分泌的物质。4.4运输4.4.1 样品宜尽快送检。干燥样品常温运输，鲜软组织等易腐败的样品应冷藏（特殊时干冰冷冻）运输。4.4.2 4.2每个样品应分别包装，在样本袋或容器外标记清楚，再将各样品放到统一包装袋或盒中。4.4.3 抗凝管等玻璃容器，放入盒内，加垫缓冲材料周定，防止晃动、破裂.4.4.4 包装应防水、防漏、密封性良好。4.4.5疑似疫病（如禽流感等）动物样品，应先消毒处理后，包装按照NY/T5412016中7.2的规定执行。5DNA饕定程序的构成DNA鉴定程序包括5个操作步骤，检材无形态鉴别特征时，有4大类方法可选：检材具有部分形态鉴别特征或理化鉴别指标等时，可与之结合进行综合

13、判断，程序流程图如图1所示。图1DNA鉴定程序流程图6DNA鉴定程序6.1 样品前处理a1.1骨、角等用75%乙醇或去离子水等清洗表面2次3次，粉碎（必要时脱钙）处理。6.1.2 皮张、蛇蜕等新鲜皮张等去除表层，剪碎或研磨。干燥皮张等应先用75%乙醇或去离子水等清洗2次3次，缓冲液浸泡去除表层，再剪碎或研磨。6.1.3 肌肉等组织新鲜干净组织直接剪碎或研磨。干燥组织应先用缓冲液浸泡、去除表层，再剪碎或研磨。61.4毛、羽等用75%乙醇、去离子水等充分清洗、剪碎。1.1.1 DNA提取1.1.2 取要求依据检材类型和DNA物种鉴定日标，确定DNA提取方法，应设置空白对照并严防交叉污染。1.1.3

14、 苯酚氯仿提取法适用于组织、血液等样品量充足的检材，按照GA/T383的相关规定执行。1.1.4 盐析提取法适用于组织、血液等样品量充足，且需要大片段DNA进行全基因组测序的检材。1.1.5 附柱试剂盒适用于组织、血液等样品量充足的检材，毛、羽等微量检材以及粪便等检材，应严格按照说明书操作。1.1.6 嘏法试剂盒适用于毛、羽等微量检材以及粪便等检材，应严格按照说明书操作。1.1.7 全自动工作站法适用于大批量样品，应严格按照仪器说明书操作。1.1.8 其他提取方法使用等效DNA提取试剂盒，或验证的新方法。6.3 DNA纯化可选择高质量纯化试剂盒或同行验证的纯化方法。6.4 DNA质W6.4.1 分光光度法按照GB/T34796方法，测定DNA浓度，并判定DNA纯度。1.1.1 评估DNA片段大小，判断DNA完整性（见附录A）,.6.4.3 qPCR法检测样品日标基因的Ct值，分析DNA含量。6.4.4 5ttt检测与DNA结合荧光染料的荧光强度，定量日标DNA的浓度。6.5检测方法6.5.1 PCR法6.5.1.1 通用引物测序法6.5.1.1.1 设置对照应严格设置阴性对照（不加DNA的空白对照）与阳性对照（已知物种的DNA样品，必要时）6.5.1.1.2 扩增与测序确定日标区域（如DNA条形码、Cytb基因等），选择