项目202012631033厦门医学院“大学生创新创业训练计划”项目结题验收表.docx

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1、项目编号:厦门医学院“大学生创新创业训练计划”项目结题验收表所在系：药学系项目名称：仙景槟榔芋病毒RT-PCR一步式快速检测体系的建立项目负责人：李欣霞学号:项目类型：因创新训练口创业训练口创业实践项目级别：国家级IZI省级口校级指导教师：曾颖指导教师单位：厦门医学院项目起止：2020年6月至2022年6月教务处20年月日项目名称仙景槟榔芋病毒RT-PCR一步式快速检测体系的建立项目负责人姓名李欣霞性别女学号所在系药学系E-mail电话主要成员(不含负责人)姓名性别所在系专业班级学号项目分工吴玲玲女药学系18生物制药2班病毒RNA提取与优化王靖女药学系19生物制药1班整理数据林雅莉女药学系19

2、生物制药1班RT-PCR体系的探索蓝建明男药学系19生物制药1班收集资料指导教师姓名曾颖职称实验师学历/学位硕士研究生单位厦门医学院药学系邮箱联系电话项目结题报告(一至六项字数不少于5000字，可根据需要另加页)一、项目简介及项目创新点本项目以厦门市集美区灌口镇田头村仙景社的名优地方品种一一仙景槟榔芋为研究目标，通过分子生物学手段(RT-PCR)检测该芋种现存的病毒病种类及其发病率，同时从反转录和PCR等方面优化RT-PCR反应条件及步骤，构建一条快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR一步式病毒检测体系，为未来仙景芋的种苗脱毒人工繁育及田间试验提供技术保障，提高芋的品质和产量，将生物学技

3、术运用到实际农业生产中去，从而助推地方农业产业振兴与发展。本项目将依托灌口镇田头村仙景芋种苗脱毒育种的科技计划项目展开。前期已进行多次田间调研及农户座谈，基本掌握仙景芋种植情况及病害问题。仙景槟榔芋，属天南星科芋属，产于厦门市集美区田头村仙景社，是厦门市的名优地方特色品种，以其口感松酥、软糯、细腻著称，2001年注册“仙景芋”商标。仙景芋栽培历史悠久，清朝光绪年间已有记载且闻名内外。1972年尼克松访华期间，仙景芋被选为国宴用料；厦门市南普陀等各大知名餐厅长期将仙景芋作为固定供应食材。仙景芋市场遍及港澳及东南亚地区，更有民间传言“买芋头就买仙景芋”。仙景芋虽具有良好的品牌基础和市场竞争力，但常

4、年处于供不应求的状态，主要是由于目前芋的种植和留种方式较为传统，多年来均采用子芋自留自繁的自然选择型种植方式，导致芋的病毒病常年留存于芋种苗内，致使芋种性退化、种源带病、种质不稳，产品质量安全难以保障，最终无法形成标准化和规模化的现代化生产种植模式。芋是许多太平洋岛国和非洲国家(如斐济、巴布亚新几内亚、科特迪瓦、加纳等)的传统主食，也是他们重要的进出口物资。芋作为中国贸易量最大的水生蔬菜，其产业的发展对促进农民就业增收,农产品特色优势区的建设发挥了重要作用。我国作为芋头生产大国之一，芋头的出口总量和出口总额远高于进口总量和进口总额，2016年出口量占世界芋头出口量的81.6册芋(COloCaS

5、iaesctdentaL.Schott.)是天南星科(AraCeae)芋属，多年生宿根草本植物，为一种典型的无性繁殖作物，通常采用球茎播种方式进行轮作，但其病毒很容易通过种子团在体内蓄积，逐代感染芋种子造成品种严重退化，严重影响作物的产量和质量。芋受多种病毒侵染，且复合侵染严重，芋病毒病是严重影响芋产量和品质的主要病害之一。现有研究表明，芋头在植物中有各种病毒感染，有些病毒是通过介质传播的，许多病毒在无性繁殖过程中在植物体内积累，导致变异病毒不断发展，造成了芋种性退化，产品质量与产量逐年下降，种植成本高但经济效益低，现有种植户数量不断减少，产业发展受限。据国内外文献报道，目前侵染芋的病毒主要有

6、8种：芋花叶病毒(DaSheenmosaicvires,DsMV)香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus)、大杆(菌)状病毒(Largebaci11iforInvirus)小杆(菌)状病毒(SnlaIlbacillifornlvirus)芋瘦小病毒(COloCaSiabobonediseasevirus,CBDV)芋叶脉缺绿病毒(TaroChIOrotiCveinvirus,TCVV)(PearsonMN,1999)及黄瓜花叶病毒(CUCUmbermosaicvirus,CMV),国内报道发现的仅有芋花叶病毒(DaShCenmOSaiCvirus,DSMV)和黄瓜花叶病毒(CU

7、CUmbermosaicvirus,CMV),其它几种病毒只在斐济、巴布亚新几内亚等太平洋岛国有发现报道，而其它国家和地区的芋病毒种类尚未有系统研究。在侵染芋的几种主要病毒中，仅有DSMV研究得较为深入，而其它几种病毒的研究则十分有限，其相关生物学和分子生物学信息还不清楚。近年来，随着我国芋头生产新技术的不断提高与应用，加之种植面积的逐步增加，芋头产量也呈现了逐年上升的趋势。在生产中，芋头主要是以无性繁殖的方式来繁育后代，因此，病毒不断积累，且病毒复合侵染的现象也很普遍，这些病毒主要包括芋花叶病毒、芋杆状病毒和黄瓜花叶病毒等，进而造成其品质变劣和产量下降，严重影响了我国芋头产业的发展：其中，D

8、SMV为芋头生产上分布最广、危害最大和研究报道最多的病毒种类。该病毒侵染芋头以后，往往造成植株的生长势下降，芋头的球茎变小、数量减少，以及品质变劣等特征。芋长期利用球茎进行营养繁殖，已普遍受到芋花叶病毒的侵染。感染病毒的植株生活力降低，球茎大小、数量和品质下降，其产量损失近60%,并且，芋种越冬较困难，生产周期长，不利于新品种的及时推广，严重影响芋的生产、出口及国际间种质资源的交流和保存工作。到目前为止，还没有一种有效的防治措施，因此进行芋的脱毒研究，建立脱毒种芋繁育体系，以满足生产所需。茎尖培养是感病植株获得无病毒材料的最有效手段。DsMV最早于20世纪60年代在美国佛罗里达州由ZettIe

9、r等发现，并确定为马铃薯Y病毒属（PotyVirUS）的成员。该病毒可经种苗、种子、机械摩擦和蚊虫、粉介等媒介昆虫传播。由于天南星科植物以无性繁殖为主，所以病毒主要随着这些小苗、小芽或植物组织等繁殖材料而传播，此外在种植和田间管理期间的人工操作可造成机械摩擦传播病毒，在自然条件下，此病毒在天南星科植物问的传播主要是通过桃蛎、棉螃和豆蛆等以非持久方式传播。CMV的寄主范围十分广泛，侵染寄主后可以表现多种典型的症状。其中常见的有花叶和植株矮化；此外，还有系统坏死等症状。该病毒在自然条件下主要通过种子、苗木等繁殖材料或介体昆虫传播；据报道，至少有75种蛇虫能以非持久传毒的方式来传播该病毒，在特定条件

10、下，大约有20种病毒可以通过种子传播，同时，能传播该病毒的菟丝子多达10余种。根据仙景槟榔芋种植过程中出现的病毒病判断可能存在的病毒种类，设计相应的特异性引物对，通过对试剂浓度和反应条件进行优化，建立一步法快速检测芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus,DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的RT-PCR检测体系，为仙景槟榔芋病毒的高效检测提供有效手段，同时为该芋种苗人工脱毒繁殖提供技术支持。项目的创新性，其研究对象为当地特色品种一仙景槟榔芋，目前对该地方品种尚未有相关研究。本研究运用了灵敏度高、快速且特异性强的最新病毒检测方法一RT-PCR技术，

11、对目标芋种进行病毒检测与分析，同时建立一步快速检测多种芋病毒的体系。并且对芋病毒样本RNA提取步骤的单因素优化。二、项目申报时的预期效果（1）获得仙景槟榔芋的主要病毒种类；（2）构建并优化一步式多种病毒RJPCR体系，获得一条快速病毒检测方法；（3）撰写实验总结报告或相关论文。.三、项目实施情况（就研究目标、研究过程、研究成果、研究体会和心得作全面总结）本项目旨在通过分子生物学技术手段(RT-PCR)对传统种植的仙景芋病毒病进行快速检测分析，建立一条快速简便的检测方法，为后续种苗脱毒实验、实验室人工育种及田间试验提供技术支持，真正将理论知识运用于实践，服务地方农业产业，为乡村产业振兴做贡献。在

12、厦门市集美区灌口镇田头村仙景社采集带有病毒性状的叶片，芋花叶病毒大多产生羽状花叶、收缩、叶脉和茎的坏死、黄绿色斑纹等。严重程度与菌株抗病性、病毒系统、环境温度以及植物肥水管理状况有关；黄瓜花叶病毒可出现花叶病、植株矮化、全身坏死等症状。目前国内对植物RNA提取的优化多在提取所用试剂的选用上，通过对过程方法的优化研究较少，本研究从植物叶片研磨过程的角度通过正交实验确定了一条高效提取芋叶总RNA的路径方法，以获得高纯度和浓度的芋叶总RNA；并在此基础上构建针对DsMV的快速、简便、灵敏度高、特异性强的一步式RT-PCR病毒检测体系，为芋病毒快速检测提供了高效简便且灵敏度高的技术手段。对后续农作物相

13、关的脱毒快繁、抗病毒育种及种性提质方面的实验研究提供新思路。收集分装好的样品，进行RNA提取，在植物提取RNA的过程中，植物组织总RNA的提取是基因体外翻译、构建CDNA文库、研究基因的表达和调控，由于高效快速的提取无污染的完整的植物病毒RNA是对其进行基因表达分析和基因克隆的必要条件，因此研究对RNA提取条件，研磨时间、研磨频率、钢珠个数等方面进行优化，通过浓度的数据进行整理和分析，所得出最佳条件为研磨时间25Inin,研磨频率30(ls),钢珠1个。根据NCBIGenBank中收录的DsMV病毒外壳蛋白(CP)基因核苜酸序列的保守区域设计病毒引物。通过CDNA试剂盒将所提的RNA进行逆转录

14、，再以文献中芋病毒的PCR体系进行优化。其中，CDNA合成反转录体系(20HL)取芋叶总RNA样品5Ug作为模板，按照CDNA试剂盒说明书的操作步骤完成CDNA链的合成，具体操作步骤为：(D将提取的RNA与试剂在冰上解冻。(2)该反应体系体积数为20uL,其中OIigod(T)IUL,TotalRNA5uL,5TURE4L,用RNaSe-FreeddH20补水到20ULo(3)充分混匀后，42孵育30min；85C孵育5S之后放于冰上，得到的CDNA低温保存待用。PCR反应为(1)PCR体系(25UL)：模板为cDNA2.0L,上游引物(10Umol/L)1.0UL,下游引物(10molL)1

15、.0L,dNTPs0.5L,10Taqbuffer(Mg2+)2.5ULTaq酶0.2L,用ddH20补足25UL。阴性对照模板为2.0IILddH20。阴性对照模板为1.0ULddH20。(2)反应条件为：94预变性3min,94变性30s,56C退火30s,72C延伸Imin,循环35次；最后72延伸IOmin。PCR反应结束后，取出扩增产物5ML进行琼脂糖凝胶电泳检测。实验设三组平行，反复验证，重复性强。根据文献体系参考对一步式体系进行优化，得出一步式RT-PCR总体系(25L)：模板为芋叶总RNA1.0L,10PCRbuffer2.5L,Mg2+1.2L,10mmol/LdNTPs1L,20PnlOl/L上游引物和下游引物各1L,逆转录酶LOL,5ULTaqDNA聚合酶1.0L,ddH20处理水补足25L。阴性对照模板为1.0ULddH20。反应程序：4260min,94C变性30s,55退火30s,72延伸1min,30个循环，72延伸10mine反应结束后，取出扩增产物5L进行进行琼脂糖凝胶电泳检测。利用现的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选取特异性好、产量高的PCR产物送往公司进行测序。在最终的芋病毒检测结果中，仙景槟榔芋只检测出了DSMV,而未有检测到CMV,