显微镜成像方法与技术3.ppt

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1、第三讲、电子显微镜镜第三讲、电子显微镜镜 电子显微镜电子显微镜 电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束电子束和电子透镜电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前透射电镜的分辨力可达0.2nm。电镜的分类电镜的分类 电子显微镜按结构和用

2、途可分为透射式电子显微镜透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜扫描式电子显微镜、反射反射式电子显微镜式电子显微镜和发射式电子显微镜发射式电子显微镜等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质成分分析；发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。电镜的分辨本领电镜的分辨本领 在光学中，分辨率（分辨极限）即指光学仪器可以分辨的两个物点之间的最小距离。由于瑞利斑（爱里斑）瑞利斑（爱里斑）的关系，显微镜物镜的分辨极限为：0.61/n sin 式中为入射光波长，n是物方介质的折

3、射率，2为物镜对物体的张角（孔径角孔径角），n sin为物镜的数值孔径数值孔径，以N.A.表示。通过增大数值孔径或缩短光源波长都可以提高物镜的分辨率。从增大数值孔径N.A.来提高分辨率是很有限和困难的，最有效的方法是缩短光源的波缩短光源的波长长，电镜所采用的电子波长为：12.25/V 可见，只要提高加速电压V就可以得到短波长的电子波，分辨率也就相应得到提高。物体物镜一、透射电镜一、透射电镜 透射式电子显微镜（TEM，Transmission Electron Microscopy，亦称投射式电子显微镜）因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿，可以直接获得一个样

4、本的投影。通过改变物镜的透镜系统人们可以直接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本的晶体结构。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。由于电子需要穿过样本，因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原原子量子量、加速电子的电压电压和所希望获得的分辨率分辨率决定样本的厚度厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低，样本就必须越薄。样品较薄或密度较低的部分，电子束散射较少，这样就有较多的电子通过物镜光栏，参与成像，在图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密，则像的对比度就会恶化

5、，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。JEM-2010F透射电镜 第一部实际工作的TEM，现在在德国慕尼黑的遗址博物馆展出。工作原理工作原理 透射电镜的总体工作原理是：由电子枪电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；经过物镜物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜中间透镜和第1、第2投影镜投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏荧光屏板上；荧光屏将电子影

6、像转化为可见光影像以供使用者观察。基本的基本的TEM光学元件布局图光学元件布局图 TEMTEM的结构的结构 TEM TEM由几大部分组成：照明系统；成像系统；记录系统；真空系统；电气系统。1.1.照明系统照明系统 主要由电子枪电子枪和聚光镜聚光镜组成。电子枪电子枪 是发射电子的照明源。聚光镜聚光镜 是把电子枪发射出来的电子束进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。电子枪的构成电子枪的构成 2.成像系统成像系统 即电子光学系统电子光学系统，又称镜筒镜筒，是透射电镜的主体。成像系统主要由物物镜、中间镜镜、中间镜和投影镜投影镜组成。物镜物

7、镜 是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子透射电子显微镜显微镜 分辨本领的高低主要取决于物镜。分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。物镜是一个强激磁短焦距的透镜，它的放大倍数较高，一般为100-300倍。目前，高质量的物镜其分辨率可达0.1nm左右。中间镜中间镜 是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在0-20倍范围调节。当M1时，用来进一步放大物镜的像；当M1时，用来缩小物镜的像。在电镜操作过程中，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。TEM分裂

8、极靴设计透镜示意图分裂极靴设计透镜示意图 投影镜投影镜 的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像（电子衍射花样）进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小（约10-3rad），因此它的景深和像距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。有时，中间镜的像平面还会出现一定的位移，由于这个位移距离仍处于投影镜的景深范围之内，因此，在荧光屏上的图像仍旧是清晰的。电子图像的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之乘积电子图像的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之

9、乘积。3.观察和记录装置观察和记录装置包括荧光屏荧光屏和照相机构照相机构。在荧光屏下面放置一下可以自动换片的照相暗盒，照相时只要把荧光屏竖起，电子束即可使照相底片曝光。由于透射电子显微镜的焦长很大，虽然荧光屏和底片之间有数十厘米的间距，仍能得到清晰的图像。TEM的电子源在顶端，透镜系统（4、7、8）将电子束聚焦于样品上，随后将其投影在显示屏（10）上。控制电子束的设备位于右方（13和14）。4.真空系统真空系统 真空系统的作用有两方面，一方面可以在阴极和地之间加以很高的电压，而不会将空气击穿产生电弧，另一方面可以将电子和空气原子的撞击频率减小到可以忽略的量级，这个效应通常使用平均自由程平均自由

10、程来描述。标准的TEM需要将电子的通路抽成气压很低的真空，通常需要达到104 帕帕。由于TEM的元件如样品夹具和胶卷盒需要经常插入电子束通路，或者需要更换，因此系统需要能够重新抽成真空。因此，TEM不能采用永久密封的方法来保持真空，而是需要装备多个抽气系统以及气闸。样品制备样品制备 透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的方法有：超薄切片法超薄切片法、冷冻超薄切片法冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法冷冻蚀刻法、冷冻断

11、裂法冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。透射电镜样品制备透射电镜样品制备：取材（小于1立方毫米）固定脱水包埋固化切片（50-60 nm）双染色电镜观察莱卡超薄切片机 TEM 样品支撑网格，其上有一超薄切片超薄切片。一个单轴倾斜样品夹具，它可以插入TEM的测角仪。倾斜这个夹具可以通过旋转整个测角仪来实现。内质网透射电镜图（伪彩色）冰冻蚀刻电镜照片 TEM的局限性的局限性 上世纪，TEMTEM的最佳分辨率为1.41.4（日本日立制作最新型300万伏超高压电子显微镜）。由于电子透镜球面像差的限制，也由于生物样品的反差不足，电镜分辨率不能达到理论的极限值11的水平。电子显微镜

12、的分辨本领虽已远胜于光学显微镜，但电子显微镜因需在真空条件下电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电镜对于电子束通道（即镜筒内腔镜筒内腔）的真空度要求很高，镜筒部分真空的好坏是镜筒部分真空的好坏是决定电镜能否正常工作的关键之一决定电镜能否正常工作的关键之一。因为在电镜中，高速电子与气体的相互作用，会使高速电子散射而偏离直线轨道，所以要使镜筒中的残余气体尽量的减少以保证电子的自由行程。电镜镜筒中的电子行程约为1m1m，经计算真空度应为1.33X101.33X10-1

13、 1PaPa。一般超高压电镜的真空度可达到这个水平。二、扫描电镜二、扫描电镜 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）的制造是依据电子与物质电子与物质的相互作用的相互作用。当一束高能的入射电子轰击物质表面时，被激发的区域将产生二次电子、二次电子、俄歇电子、特征俄歇电子、特征X射线射线和连续谱连续谱X射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。红外光区域产生的电磁辐射。同时，也可产生电子-空穴对、晶格振动(声子)、电子振荡(等离子体)。原则上讲，利用电子和物质的相互作用，可以获取被

14、测样品本身的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。扫描电子显微镜正是根据上述不同信息产生的机理，采用不同的信息检测器，使选择检测得以实现。如对二次电子、背散射电子的采集，可得到有关物质微观形貌的信息；对x射线的采集，可得到物质化学成分的信息。正因如此，根据不同需求，可制造出功能配置不同的扫描电子显微镜。二次电子二次电子 Secondary electron 二次电子是指被入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核和外层价电子外层价电子间的结合能很小，当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能结合能的能量后，可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生

15、在比较接近样品表层处，那些能量大于材料逸出功逸出功的自由电子可从样品表面逸出，变成真空中的自由电子，即二次电子二次电子。二次电子来自表面5-10nm的区域，能量为0-50eV。它对试样表面状态非常敏感，能有效地显示试样表面的微观形貌。由于它发自试样表层，入射电子还没有被多次反射，因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别，所以二次电子的分辨率较高，一般可达到5-10nm。扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨率率。二次电子产额随原子序数的变化不大，它主要取决于表面形貌。入射电子与样品核外电子碰撞，使样品表面的核外电子被激发出来，作为SEM的成像信号

16、，代表样品表面的结构特点。SEM的构成的构成 扫描电子显微镜由三大部分组成：真空系统真空系统，电子束系统电子束系统以及成像系统成像系统。1.1.真空系统真空系统 主要包括真空泵真空泵和真空柱真空柱两部分。真空柱是一个密封的柱形容器。成象系统和电子束系统均内置在真空柱中。2.2.电子束系统电子束系统 由电子枪电子枪和电磁透镜电磁透镜两部分组成，主要用于产生一束能量分布极窄的、电子能量确定的电子束用以扫描成象。电子枪用于产生电子，主要有两大类。一类是利用场致发射效应场致发射效应产生电子，另一类是利用热发射效应热发射效应产生电子。电磁透镜 热发射电子需要电磁透镜来成束，所以在用热发射电子枪的SEM上，电磁透镜必不可少。通常会装配两组，汇聚透镜汇聚透镜和物镜物镜。汇聚透镜用于汇聚电子束，装配在真空柱中，位于电子枪之下。通常不止一个，并有一组汇聚光圈与之相配。但汇聚透镜仅仅用于汇聚电子束，与成象会焦无关。物镜为真空柱中最下方的一个电磁透镜，它负责将电子束的焦点汇聚到样品表面。3.3.成像系统成像系统 电子经过一系列电磁透镜成束后，打到样品上与样品相互作用，会产生次级电子、背散射电子、俄歇电子以及