最新结核分枝杆菌耐药性检测专家共识要点.docx

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1、最新结核分枝杆菌耐药性检测专家共识要点摘要耐药结核病尤其是耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）是目前临床亟待解决的难题之一，而对抗结核药物进行药物敏感性试验（DST）可为耐药结核病的诊断提供实验室依据。本专家共识简要地介绍了我国临床常用的结核分枝杆菌（MTB）DST方法（包括表型DST和分子DST）;提出了MTB耐药性检测策略和正确判读检测结果的建议；指出目前DST检测技术和临床应用存在的问题，并对未来DST的发展前景进行了展望。结核病（TB）是全球及我国严重的公共卫生问题，耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）是目前临床亟待解决的难题之一。因此，

2、快速、准确地检测标本中耐药结核分枝杆菌（MTB）,快速诊断耐药结核病（DR-TB）,对有效控制DR-TB疫情是至关重要的。随着MTB耐药分子机制的阐明，快速的分子药物敏感性试验（DST）和表型DST新方法的建立并在临床上广泛应用，需要建立更趋完善的、规范的MTB耐药性检测方法和流程，以便结核病临床医生、检验人员和防控人员能够适宜地应用检测方法，正确判读检测结果，进而提高DR-TB的诊治水平，加快DR-TB的控制。我国常用的MTBDST检测方法目前在我国临床应用的MTBDST检测方法根据其原理主要有两种类型：表型DST和分子DST。一、表型DST检测方法该方法是建立在培养基础上的，通过对比观察M

3、TB在含药和不含药培养基中的生长情况来检测其耐药性，是目前耐药性检测的“金标准”。耐药性检测所采用的药物浓度通常依据最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)确定，或按照机体药代动力学指标制定，在体外可将耐药菌株与敏感菌株分开。绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。(一)传统的DST方法在含和不含一定浓度抗结核药物的固体培养基上，检测MTB的生长情况以判断其对药物的敏感性，我国常用绝对浓度法和比例法。1 .

4、绝对浓度法(absoluteconcentrationmethod)：将1mg/ml菌悬液用生理盐水倍比稀释至10-2mg/ml,吸取0.1ml菌液分别接种于含高、低浓度药液培养基和对照培养基上，置37培养4周，按下列方式报告菌落生长情况：分枝杆菌培养阴性（一）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性（+）：菌落生长占斜面面积的1/4;分枝杆菌培养阳性（+）:菌落生长占斜面面积的1/2;分枝杆菌培养阳性（+）：菌落生长占斜面面积的3/4;分枝杆菌培养阳性（+）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜面上菌落数少于20个时，报告菌落数。2 .比例法（ProPortiOnmethod）：将1mg/ml菌悬液用生

5、理盐水倍比稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml,分别取0.01ml的10-2mg/ml和10八-4mg/ml的稀释菌液同时接种于含药培养基和对照培养基上，置37培养4周，将含药培养基上的可计数菌落数与对照培养基上的可计数菌落数相比，比值大于1%即判断为耐药。若高稀释度菌液（10-4mg/ml）在对照培养基上生长的菌落数少于20个，则应从对照管传代培养，进行重复试验。比例法与绝对浓度法耐药性检测的一致率均在80%以上,尤其是对利福平（RFP）的耐药性检测一致率达90%以上，比例法的耐药检出率高于绝对浓度法。传统DST方法的优点是可同时检测一线如RFP、异烟明（INH）、乙胺丁醇（EMB）

6、和链霉素（Sm）和二线卡那霉素（Km）、阿米卡星（丁胺卡那霉素，Am）、卷曲霉素（Cm）、氟嗪诺酮类（FQs）、乙硫异烟胺（Eto）、丙硫异烟胺（Pto）对氨基水杨酸（PAS）、环丝氨酸（Cs）共十几种抗结核药物的耐药水平，已有商业化的产品，简单、经济，适用于基层；最近对贝达喋咻（Bdq）、德拉马尼（Dlm）和利奈嘎胺(LZd)的DST方法已通过验证。其缺点是对EMB、毗嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS和CS进行DST的检测结果不可靠，而且培养时间长，平均需30d以上的时间，试验结果易受含药管中实际药物浓度、MTB接种量和细菌活力的影响。(二)分枝杆菌液体培养DST检测方法通过分枝杆菌液体培养

7、系统采用比例法进行DST,设置1管生长对照管，PZA还需另外设置1管专用的生长对照管，其余管分别加入测试的一线抗结核药物INH、RFP、Sm、EMB、PZA,置37培养至自动报告结果。其优点是与传统的DST具有较高的符合率，较快速，平均只需810d时间，WHO认可应用快速培养系统开展MTB对部分二线抗结核药物的DST如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、EtO等;最近对BdqDlm和氯氟嗪(clofazimine)的DST检测方法已通过验证。其缺点是进口的仪器和试剂较昂贵、易污染。(三)分枝杆菌MlC检测法是基于微量肉汤稀释法原理，应用比例法检测十几种一线和二线抗结核药物的耐药性如Sm、INH、R

8、FP、利福喷丁(Rft)、利福布汀(Rfb)EMBOfX、左氧氟沙星(LfX)、莫西沙星(Mfx)、KmAm、Cm、EtoPto、PAS、对氨基水杨酸异烟期z(PaSiniaZide,Pa)、Cs、克拉霉素（Clr）和氯法齐明（CfZ）L只需714d时间。其优点是大多数药物与传统的DST具有较高的符合率（84.6%Ioo%）,可获得较多二线抗结核药物的耐药情况，实现了结果判读的自动化，为临床提供更确切的耐药信息；缺点是实际应用中某些药物的MIC值不好判读。二、分子DST方法该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检测MTB的耐药基因型（表1）。分子DST已成为DR-TB的

9、确诊方法之一，其建立在基因扩增基础上，快速（248h）、敏感地从MTB分离株或预处理的临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提取后标本的传染风险降低。但分子DST存在下列缺点：（1）只有部分抗结核药物特异的耐药相关突变基因被发现，目前的耐药基因检测试剂也只能检测已发现的抗结核药物主要耐药基因型。因此，分子DST检测MTB耐受药物的种类有限；（2）分子DST无法确定标本中耐药细菌的比例，而可能难以检出野生型和突变型菌株混合形成的异质性耐药（即从患者体内同时分离出敏感菌株和耐药菌株的现象），也可能无法检出表型D

10、ST耐药水平的耐药菌株（如：比例法可阳性检出仅含1%耐药菌株的标本，而分子DST可能难以检出）；（3）某些分子DST可能检出不影响耐药表型的同义突变（氨基酸没有改变）、沉默突变（不影响编码蛋白的表达，结构或功能无显著变化），从而导致不能鉴定突变性质的分子DST方法存在报告假耐药的可能性；（4）不同地区流行的MTB菌株的耐药基因型并不完全相同，而目前商业化的MTB耐药检测试剂并未涵盖所有的耐药突变位点，因此，分子DST并不能检出MTB所有表型耐药菌株，而可能出现假阴性。由此可见，分子DST不能完全取代传统表型DST,可作为耐药MTB快速筛查方法和（或）传统DST的补充。（一）实时荧光定量PCR技

11、术采用半巢式实时PCR技术快速、自动化地同时检测MTB基因及RFP常见耐药决定区域，核酸提取、扩增、检测一体化，操作简便，整个检测过程只需2h,生物安全性高，不易污染，可用于除血液外的各种临床标本的检测；但只能检测RFP的耐药性，不报告具体的突变类型。（二）探针熔解曲线法采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、SrmEMB和FQs常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整个检测过程只需23h,可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射

12、类药物耐药）；其缺点是不报告具体的突变类型。（三）基因芯片技术采用基因芯片技术较简便、快速地检测MTB对RFP和INH耐药的常见基因型，可了解突变的位点和性质，辅助诊断MDR-TB,整个检测过程只需2448h;其缺点是杂交、检测过程较繁琐。（四）反向杂交技术采用反向杂交技术可同时快速检测对RFP、INH、EMBFQs、Am、Km和Cm耐药的常见基因型，可了解突变的位点和性质，辅助诊断MDR-TB和Pre-XDR-TB、XDR-TB,整个检测过程只需12d时间；但其为开放性检测，可能会污染扩增产物而导致假耐药的报告，并且杂交、显色过程较繁琐。（五）基因测序技术采用PCR-Sanger测序方法检测

13、MTB对RFP和INH耐药的常见基因型，可了解突变的位点和性质，但目前尚未在临床广泛开展。MTB耐药性检测策略目前，采用任何单一形式的DST方法均无法完全满足临床需求,而采用多种方法联合检测虽能提高耐药MTB的检出率、缩短诊断时间，但同时也增加了TB患者的检测费用，而且若不同检测方法的结果不一致,也给医生的诊断和化疗方案的制定带来许多困扰。因此，本共识提出MTB耐药性检测的策略（见图1）,以指导合理地选择DST方法进行耐药性联合检测，为临床DR-TB的快速、准确诊断和早期有效治疗提供实验室依据。一、生物学安全与质量控制根据中华人民共和国国家卫生健康委员会办公厅颁布的人间传染的病原微生物名录（2

14、018年修订）规定，TB患者标本DST需在生物安全11级实验室根据生物安全通用要求开展；应实施完善的检验质量控制（QC）系统，并具有良好的可重复性和较高的可信度；分子DST还需在符合基因扩增规范的实验室进行，预防扩增产物污染而导致假阳性结果,保证和提高检验质量，确保MTB耐药性检测结果的可靠性。二、建议表型DST与分子DST联合检测，优势互补表型DST方法可确定MTB对多种一、二线抗结核药物的敏感性和药物耐受程度，是临床诊断DR-TB、制定化疗方案的主要依据；虽然尚不完善，但其是DST的“金标准，而敏感、快速的分子DST方法弥补了传统DST的不足（如耗时长、菌阴TB或普通细菌污染会导致DST无

15、结果、对PZA的DST结果不准确等）,为DR-TB的早期诊断提供了有效的手段。因此，通过分子DST对DR-TB、尤其是MDR-TB做出早期诊断，并先进行及时合理的治疗；待表型DST结果出来后，经临床综合判断是否需要进一步调整化疗方案。三、建议采用分子DST方法直接检测可疑TB患者临床标本以快速筛查MTB和耐RFP的MTB通过可直接检测的分子DST方法快速筛查临床标本（痰或肺外结核标本），可以辅助TB、RR-TB的早期诊断和鉴别诊断。尽管此类分子DST快速筛查技术无法提供较全面的抗结核药物敏感或耐药信息,但可大幅减少实验室的工作量，在没有获得表型DST结果的情况下（如：结果未出来、没有细菌生长、

16、污染或与NTM混合感染等），也能为DR-TB的诊断和鉴别诊断快速提供初步的实验室依据。四、建议采用分子DST方法直接检测涂片阳性的临床标本在进行传统培养和表型DST的同时，建议采用可检测MDR（或XDR）-MTB的分子DST方法直接检测涂片阳性的临床标本，可使约85%95%的TB患者获得早期诊断MDR（或Pre-XDRXDR）-TBo五、涂片阴性复治TB患者临床标本的处理建议先进行分子检测。若MTB核酸检测阳性，再进一步进行分子DST,可使部分涂片阴性的标本早期获得明确的耐药基因型结果。六、涂片和分子检测阴性TB患者标本的处理建议在分枝杆菌快速培养检测阳性后，再进一步进行分子DST和传统DST,以提高DR-TB的诊断率。七、RR-MTB或MDR-MTB检测阳性或XDR-TB可疑患者临床标本、培养物和（或）提取核酸