DESIMSI技术在经典名方芍药甘草汤质量控制中应用研究.docx

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1、DESI-MSI技术在经典名方芍药甘草汤质量控制中应用研究目的使用超高效液相色谱-二极管阵列检测器检测法(UHPLe-DAD)和解吸电喷雾电离-离子化质谱成像技术(desorptionelectrosprayionization-massspectrometryimaging,DESl-MSI)15批芍药甘草汤(ShaOyaO-GanCao-DeCoCtion,SGD)物质基准和对应实物进行分析，考察DESI-MSl在经典名方SGD质量控制中的优势。方法以SGD为研究模型，采用传统UHPLC-DAD法建立物质基准指纹图谱，并对SGD指标成分(芍药甘、甘草甘、甘草酸)含量、出膏率进行考察。同时，

2、以芍药甘草汤对应实物冻干粉为研究载体，将其复溶后点样于定性滤纸，并固定于载玻片制成样品，以甲醇-甲酸(1000：1)为喷雾溶剂，体积流量3L/min；扫描范围m/z1001200；空间分辨率300Um；喷雾气(N2)压力0.5MPa；离子源温度120,采用正负离子全扫描样本。结果DESI-MSl法能检测到SGD指标成分芍药甘、廿草甘、廿草酸以及共有峰成分芍药内酯昔等。同时、DESl-MSI法还能检测到来自甘草、白芍的甘草皂昔G2、甘草皂甘J2、没食子酸、柠檬酸、对羟基苯甲酸等11种成分，并对其相对含量进行直观呈现，定性分析能力远强于UHPLc-DAD法。结论基于DESI-MSI技术无需进行复杂

3、的样品前处理,可以在无对照品情况下进行复杂样品的定性、相对含量分析，灵敏度高，分析能力强，可以作为经典名方物质基准、对应实物及配方颗粒样品的质控研究方法。芍药甘草汤(Shaoyao-Gancao-Decoction,SGD)源于张仲景之伤寒杂病论。该方组方精简，疗效显著，被历朝历代医家推崇，沿用至今，并且在其基础上加减化裁，用于治疗不同的病证，被广泛应用于古、现代中医临床1。现代药理学研究和临床实践也证实，SGD具有显著的解痉2、抗炎镇痛3、止咳平喘4、保肝利胆5、抗HBV病毒6、抗纤维化7、保护胃黏膜8、免疫调节9、以及抗过敏、通便、保护跟腱组织10等作用，对多种痉挛性疾病、疼痛性疾病、炎症

4、性疾病以及支气管哮喘、帕金森病、便秘等都有显著的治疗作用lll-16o作为第一批入选古代经典名方目录的复方，SGD的煎煮工艺及质量标准研究对于后续经典名方的开发具有一定的指导意义17-18。高分辨质谱广泛应用于中药化学领域，其对复杂中药化学成分的定性定量研究，可以全面展现中药及其复方的药效成分，不仅为药理学研究提供合理参考，也为中药质量标准体系的构建提供关键依据19-21。质谱成像(massspectrometryimaging,MSD作为一种新型分子成像技术，近年来多应用于药物及其代谢物体内分布研究，利用激光或离子束使样本表面分子离子化，通过串联质谱测定离子化分子质荷比，直接从动物组织切片表

5、面获得药物及其代谢物在体内的分子组成、相对丰度与空间分布状况，并以彩色图像的形式表达2227。如王中华等28应用敞开式空气动力辅助离子化-高分辨质谱成像技术对大鼠肾脏组织切片进行成像分析，得到38种肾脏内源性产物在组织中的特异性分布，直观体现了与肾脏渗透压梯度形成有关的多种小分子代谢物皮质-髓质轴向分布特征。本研究以本课题组先前研究进展为基础29,以经典名方作为研究对象，参考伤寒论原文记载的制备方法制备15批SGD物质基准，建立基于超高效液相色谱(ultra-highperformanceliquidchromatography,UHPLC)的SGD物质基准特征图谱分析方法，同时制备对应实物，

6、确定出膏率范围。并且以SGD对应实物为研究对象，建立了基于解吸电喷雾电离(desorptionelectrosprayionization,DESD离子化质谱成像技术(DESI-MSI)的经典名方质量控制方法，对多组分进行定性定量分析，为经典名方整体质量控制研究提供新思路、新方法。1材料1290Infinityu型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，包括G7167B型自动进样系统，G7166B型柱温箱，G7117A型二极管阵列检测器（DAD）；XevoG2XSqtof.DESIMSI质谱成像系统，美国沃特世科技有限公司；BS-210S型电子分析天平，天平有限公司；LD510-2型电子天平，电子有

7、限公司；H1650-W型台式高速离心机，实验室仪器开发有限公司；LGJ-IOE真空冷冻干燥机，科技发展有限公司；HDZ20型智能煎药壶，电器厂，容量2L,额定功率500W,稳定电压220V。对照品异甘草昔、新甘草甘、芹糖基甘草甘、廿草素、异甘草素、甘草次酸、苯甲酰芍药昔、氧化芍药昔、芍药内酯甘、没食子酸、没食子酸甲酯、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖、儿茶素、丹皮酚、苯甲酸、刺芒柄花素，批号分别为，质量分数均298%,生物技术有限公司；对照品芍药昔、甘草甘、甘草酸钱，批号分别为，质量分数依次为98%、93.1%、98%,购自食品药品检定研究院；水为纯净水，甲醇、乙睛为色谱纯，其他试剂均

8、为分析纯。SGD所用饮片均由盛实百草药业有限公司提供，经农业大学食品科学与药学学院教授鉴定，饮片所用药材分别为毛葭科芍药属植物芍药PaeOniaECtiflOraPalL的干燥根，豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎，详细信息见表Io表1SGD的药材来源Table1SourceofmedicinalurerialsinSGDSGD物破基准白芍炙甘草批号产地批号产地SOlH17OO71OO1安H1805440内蒙古S02S174240S01安诵H18O2I5O内蒙占S03H170114001四处H1805450内蒙古S04S174190S01安It

9、tHl700010内蒙古SOS18030602安Hl700020内蒙古S06H170106001山东Hl700030内蒙占S07H170118001四川Hl700040内蒙古S08HI8015001帙西Hl700050内蒙占S09S172910S01安微Hl700060内蒙古SlOH17O1O5OO1山东Hlsoo570It41SllH170011001陕西Hl701740内蒙古S12HI70116001四川Hl801580内蒙占SBS18O31OSO1浙江H1801S90内蒙古SHH1801(001陕西HlSo5430内蒙占S15H170117001四川H18O11.0mL,分别加至5mL量

10、瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草昔进样质量浓度为横坐标（X）,230nm波长下峰面积为纵坐标（Y）,计算得回归方程为Y=35260.159X-111.631,r2=1.0000。精密吸取“2.1.1”项下甘草酸钱对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6mL,分别加至5mL量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草酸镂进样质量浓度为横坐标（X）,254nm波长下峰面积为纵坐标（Y）,计算得回归方程为Y=IO935.277X1.25,2=0.9999。（2）精密度考察：取同一批SGD供试品溶液（S03）,按照“2.

11、1.3”项下色谱条件连续进样6次，计算芍药甘、甘草甘、甘草酸镂峰而积RSD值分别为0.15%、0.09%、0.06%,表明仪器精密度良好。（3）稳定性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法制备1批供试品溶液（S03）,分别于配制后0、2、4、8、12、24h按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药昔、甘草昔、甘草酸钱峰面积RSD值分别为0.54%、0.79%、0.83%,表明24h内供试品溶液稳定性良好。（4）重复性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法平行制备6批供试品溶液（S03）,按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药昔、甘草昔、甘草酸钱

12、质量浓度的RSD值分别为0.79%、0.77%、0.46%,表明本方法重复性良好。（5）加样回收率试验：精密称取已知各指标成分含量的SGD物质基准（S03）,分别加入等量芍药甘、甘草昔、甘草酸镂对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，结果3者平均加样回收率分别为101.73%、100.44%、99.51%,计RSD值依次为0.54%、0.79%0.83%。2.1.5 样品测定精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件测定，计算物质基准中芍药昔、甘草昔、甘草酸钱含量。结果见表2。2.1.6 SGD出膏率研究精密吸取混合均匀的“2.1.2项下SGD物质基准10mL于蒸发皿中，40真空干燥至恒定质量，称量质量，根据出膏率公式计算物质基准出膏率。见表2。出膏率=WV/（VM）M表示药材质量，V表示SGD物质基准体积，V表示取样体积，W表示取样所得干膏质量表2SGD物质基准的指标成分含量及出杳率Table2IndexcomponentsconrentsanddryOXtraetrateofSGDsubstancebencbmarkSGD物质基准质量浓度/(mgmLT)出膏率必芍药甘