(细节决定成败)溶出方法学验证与溶出实验注意事项.docx

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1、对于药物质量研究来说，分析方法的开发和验证的重要性，在此就不再赘述了。而对于溶出度方法学验证来说，您是否具有相同的疑问？1、溶出度方法学验证与含量方法学验证内容相同吗？2、溶出方法验证中，除了标准介质以外，其他几个介质也需要同样的方法验证吗？首先回答第2个问题：在国内，每个溶出曲线所用介质中的方法学验证都需要做。巨大的工作量之前，大家更应该熟练掌握细节，做好计划，写好方案，减少偏差。今天就分享一下溶出度方法学验证的内容。x测量的产品属性类型待证r的分析方法性能特征(2)鉴别杂质(纯度)其他定量测定(1)含量测定含量/效价其他定量测定(I)定量阳度检测专属性(3)专属性试验+工作范围校正模型适用

2、性范困下限确证-+QL(DL)DL十准确度(4)准确度试验-+-+精密度(4)重复性试验中间精密度试验-+(5)-+(5)ICHQ2中出现的这个表格，对于大家来说，简直不能再熟悉。那接下来我们就继续展开一下方法验证的详细过程吧！Ol方法验证指导原则中国药典ICHQ2USP通则V1225等02验证步骤初步确定分析方法：UV法或HPLe法；根据预实验制定的验证方案,包括前期方法优化简介、验证项目及验证目的、操作要求和可接受标准；开始验证工作，收集数据及相应图谱；对验证的结果进行判断，评价分析方法是否通过验证。03验证项目专属性目的考察辅料和胶囊壳对溶出度测定是否有干扰。对于溶出实验方法而言，还需要

3、特别注意的一点是：取样时所采用的过滤装置，如滤膜、滤头等，必须要经过药物的吸附验证，防止对测定结果产生一定干扰。这一部分应在溶出方法开发阶段做充分的论证研究。首先要明确，在溶出方法学验证中，所用的溶媒是溶出介质。HPLC法的操作要求和判断标准方法的专属性符合要求，需要满足以下条件：空白溶液、空白辅料，对主要成分无干扰，在主成分的位置不出峰；具体操作方法可按处方比例配制空白辅料（含油墨或胶囊壳）的混合样品，将该混合样品溶解或分散在溶出介质中，然后向溶液中加入一定量药物，作为供试品溶液；对照品溶液和供试品溶液的峰面积相差不超过10%,也就是说对照品溶液和供试液的浓度不要相差太大，因为不同的稀释倍数

4、，稀释过程中所用的试剂、玻璃容器、溶出介质、都有可能造成专属性的误差。UV法操作要求和判断标准空白溶剂空白辅料溶液胶囊剂应配置空胶囊壳溶出液（严格按照样品溶出度测定的步骤，取6粒空白胶囊壳进行试验。尽可能完全的除尽胶囊内容物）。取这3种溶液适量，做紫外检测，记录吸光度，根据对照品溶液结果，测定干扰值。如果是胶囊产生的干扰试验，应进行囊壳的消除试验。首先空胶囊仅对UV测定有干扰，药典规定如干扰不大于标示量的2%,可忽略不计；干扰大于标示量的2%,可更换波长或者再换一种其他胶囊壳，减少测定干扰。胶囊壳的批次、来源不用、紫外吸收强度也各不相同，故干扰也常常不同。若胶囊壳的干扰较大时，建议采用HPLC

5、法进行测定。溶液稳定性试验包括对照品溶液稳定性和供试品溶液稳定性。对照品溶液取对照品溶液适量，在室温下放置，分别于不同时间点测定吸光度值/峰面积值，计算其RSD值。供试品溶液取自制样品适量，用相应介质制备成供试液，在室温下放置，分别于不同设置时间点测定吸光度值/峰面积值，计算其RSD值。可接受标准取每时间点的主峰峰面积/吸光度值，计算其RSD值，应不大于2%,则说明该溶液在此时间段内的稳定性良好。提示稳定性时间的考察以满足自己的实验需求为准。采用UV法考察稳定性时，一般稳定性做到24小时即可，缓控释制剂可相对延长时间。采用HPLC法考察稳定性时，一般需满足一条溶出曲线所有样品测定完全的时间。如

6、果溶液不稳定，还需要考虑温度（降低进样室温度或在冰箱冷藏）、避光、增加稳定剂等提高稳定性的方式。例如考虑到成本问题，对于稳定性很好的对照品，可以配置成贮备液使用，但是需要考察日间稳定性（日间稳定性就是另外一个实验方案了）。精密度试验仪器精密度取对照品溶液，连续进样6针/连续测定6次紫外吸光度值。可接受标准HPLC峰面积/紫外吸光度值的RSD不超过2.0%o重复性取待测样品1片/粒，置溶出杯中，按照溶出度方法进行测定，至取样点时取溶出液，分为6份，分别进行溶出度测定，计算RSD值。为避免溶出曲线中低浓度点的精密度，可以在第1个取样点时取溶出液，分为6份，分别进行溶出度测定，计算RSD值。可接受标

7、准HPLC峰面积/吸光度的RSD值不超过2.0%(n=6)o提示该项试验和重现性试验(批间均一性)并不相同。重复性实验证明以本方法制备供试品溶液测定时重复性良好。重现性试验时考察制剂工艺稳定性及溶出度方法重复性的一项重要指标。中间精密度在同一实验室内的条件改变，如不同时间、不同分析人员、不同设备等测定结果之间的精密度。研究过程中的典型的变化，包括不同天、不同操作人员和设备。可接受标准测定结果与重复性的结果合并计算，HPLC峰面积/吸光度RSD不超过2.0%(n=12)o而USP建议：当该时间点的溶出量小于85%时，两个分析员溶出结果的平均值相差不得超过10%；当该时间点的溶出量大于85%时，两

8、个分析员溶出结果的平均值相差不得超过5%。当然，具体的可接受标准可根据特定产品做具体规定。线性和范围取对照品适量，配成一定浓度的储备液，稀释制成一系列浓度的溶液，通常至少5个浓度点(参见USPVI225)。对于溶出度试验，应为规定范围的20%,对于缓控释制剂，该限度照样适用。如某缓释胶囊溶出度限度为第1小时：15%45%,则回收率应为最低点15%的20%。但对原料或制剂的含量测定：一般应在测试浓度的80120%o可接受标准以峰面积(吸光度值)对浓度进行线性回归，线性相关系数r不小于0.9990。y轴截距的绝对值不超过100%浓度样品峰面积的2%。提示HPLC法：最低浓度样品的色谱图中，信噪比不

9、低于10:1。UV法：最佳吸光度在0.30.7之间，根据具体样品也可以0.20.8之间。若线性贮备溶液制备过程中为了增加药物的溶解度，可能会用到有机溶剂，除非经过验证外，有机溶剂的量均不得超过总体积的5%(vv)o准确度USPVIO92建议在回收率实验之前，应排除过滤器、滤膜或是玻璃材质仪器等对药物的吸附作用，避免对测定结果造成干扰。供试品溶液配制按处方比例混合的空白辅料+不同浓度的主成分对照品或原料，再按照拟定的质量标准配制溶液，必要时可超声使主成分溶解。具体的实验方法在规定范围内，取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少6份样品的测定结果进行评价；设计至少三种不同浓度，每种浓度

10、至少平行配制3份，用至少9份样品的测定结果进行评价，回收率验证的浓度范围一般要求为限度的士20%。可接受标准各浓度下的平均回收率应在98%-102%之间，相对标准偏差RSD应不大于2.0%o提示配制溶剂尽量与溶出介质体系一致。如果药物溶解性较差，可以将药物溶解在少量有机溶剂（一般不超过5%）中制备储备液，并用溶出介质稀释到最终浓度。耐用性主要评估溶出条件故意做微小改变时对溶出方法耐用性的影响。对于该实验，最好选用具有较好质量特征（如具有较好含量均匀度）的制剂批次进行，排除制剂个体差异对该结果造成的干扰。在此很多分析员有这样的疑问：如果溶出度测定方法与含量测定方法均为HPLC法，且色谱条件一致，

11、可以共用一套耐用性数据吗？答案很明确，不可以！因为即使色谱条件一致，也会存在样品浓度和溶媒的不同，因此仍旧需要考察耐用性。试验设计同含量测定，需要考察柱温、流速、波长、色谱柱、流动相中有机相与水相比例及水相浓度和PH值。对于使用UV法测定的溶出度，照样需要考察耐用性，如波长、溶出介质浓度等。最重要一点：不管为了与QC完美对接，还是和厂家妥善交接，都需要验证不同品牌溶出仪之间的耐用性。溶出均一性包括批内均一性和批间均一性。这两项指标不但能检验药品本身质量特性是否符合规定，同时也可以检验溶出方法是否满足准确性、精确性的要求。批内均一性可取同一批次产品的6或12个剂量单位测定溶出曲线，计算各取样时间

12、点的RSD值。可接受标准早期的一些取样时间点（如5min）,要求RSD20%;其他时间点，要求RSD10%o批间均一性取不同批次产品的6或12个剂量单位测定溶出曲线，比较各批次的溶出曲线是否相似。可接受标准相似因子不得小于50。随着仿制药一致性评价工作如火如荼的开展，体外溶出曲线的测定与对比也引起了大家的重视，在CFDA发布了药物溶出仪机械验证指导原则后，相信有些研究单位会更换或增加许多先进的溶出设备，以减少旧的溶出设备引起的差异。但在验证合格的溶出仪上，重复检测样品的溶出度时，我们还是会遇到数据结果差异较大现象。而造成这种现象的原因可能就隐藏在实验过程的细节中。下面小编就为大家总结一下，在溶

13、出试验中，应引起大家注意的细节。配制溶出介质溶于溶出介质中的气体可能会干扰溶出结果的重现性。因此，在配制溶出介质前，因对纯化水进行脱气处理，具体方法有：超声、煮沸、加热至41C后真空脱气等。若使用加热脱气的方法，要等脱气结束后，水温降至室温时，再进行配制，以免加入盐酸或醋酸后，其受热挥发，影响溶出介质的PH值。不同来源的纯化水PH值不同，当使用纯化水为溶出介质时，在使用之前最好确定水的PH值，以免因水的PH值不同，造成溶出数据的变化。安装搅拌桨（篮）在溶出仪出厂、安装时（或每隔6个月），都需进行机械验证。在验证通过后的使用过程中，我们安装搅拌桨（篮）的位置与验证时的安装位置不相同，就会影响搅拌

14、桨（篮）与溶出杯的同轴度，进而影响溶出杯内溶出介质的流动状态,使样品的溶出数据发生变化。另外，有些厂家的溶出仪的搅拌桨（篮）是需要调节安装高度的，但常常我们为方便下次使用，在清洗设备时不拆除搅拌桨（篮），总认为已调好搅拌桨（篮）高度，不需再调节。但是，在使用过程中因搅拌桨（篮）的晃动，会使固定好的搅拌桨（篮）松动。长时间使用后搅拌桨（篮）的高度可能已降低，最终，使得样品的溶出度发生变化或组内溶出的平行性变差。应用转篮法进行试验时，应注意转篮的洁净程度，观察转篮空隙是否发生堵塞，如堵塞，用超声处理或在稀硝酸中煮沸、再经水中煮沸的办法进行清理，否则将影响溶出度数据的准确性。同时，还应注意转篮的形状

15、是否完整，如发生扭曲变形，应及时更换新的转篮。安装溶出杯溶出杯与搅拌桨（篮）一样有不同的编号。使用时也应将溶出杯安装到对应的位置。除了溶出杯的编号要对应外，溶出仪通过了垂直度与同轴度验证后，溶出杯上缘与固定装置相连的位置上都做好标记。如：竖线、箭头。因此，在进行溶出度试验时，应将各篮轴、桨和溶出杯放在原已通过验证的位置上，保持各溶出杯与固定装置的相对位置不变。但是大家在安装溶出仪时往往会忽略这点，使的溶出杯的轴度与搅拌桨的轴度不重合，进而改变溶出杯内溶出介质的流动状态，使溶出数据发生变化。安装滤头现在溶出仪一般为全自动或半自动取样，在自动取样溶出仪的取样端，一定要安装滤头，若不在取样针的取样端安装滤头，未溶解的样品颗粒会随取样溶液进入仪器管路一方面，未溶解的颗粒可能堵塞管路，使仪器取样量不准确；另一方面，因为样品从取样端转移到试管的时间（根据取样量不同）一般会有2-5min的间隔,未溶解的颗粒在管路中转移时也会继续溶解，因此会影响测量的准确度或最终溶出度。试验结束后，使用