临床生化反应曲线基础理论操作方法及注意事项.docx

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1、临床生化反应曲线基础理论操作方法及注意事项生化反应曲线是整个生化反应过程的记录，通过查看反应曲线我们可以知道这个结果是否可靠，也可以发现一些仪器故障（试剂针加样不足、冲洗机构冲洗问题），也能提醒光源灯能量不足，也能查看速率法项目是不是底物耗尽。生化反应曲线基础理论分光光度仪原理，运用的是朗伯-比尔定律：A=KbCA为吸光度，K为摩尔吸光系数，它与吸光物质的性质及入射光的波长人有关，c为吸光物质的浓度，单位为molL,b为吸收层厚度，单位为cmoLambert-Beer定律适合于任何均匀非散射的介质，当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度。光路系统可以测量后分光后

2、12个波长的相应吸光度。常用波长：340,376,415,450,480,505,546,570,600,660,700,800nm,多数检测项目都使用双波长检测方法。全自动生化分析仪常用的方法：终点法和速率法。终点法（一点终点法、两点终点法）被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。一点终点法：在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：

3、待测物浓度CU=（待测吸光度AU一试剂空白吸光度AB）KK为校准系数两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时,选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。2、连续监测法（速率法）是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（AAmin）计算结果。可以确定线性期并计算AAmin,根据此值再准确地计算酶活性，使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（UL）=AAmi

4、nX理论（或校准）K值。代谢物浓度CU=AA/minX校准K值。反应曲线那么，对应的生化项目检测(以奥林巴斯AU系列为例)是这样的：首先，仪器会向反应杯加入试剂I(R1),紧接着加入样本(三),搅拌混匀，3分钟后加入试剂2(R2),搅拌混匀。在这个过程中，仪器会每隔18秒测试一次吸光度并记录，总共28(0-27)个点，然后连接成线，见下图：反应曲线是项目检测整个过程记录，相当于是一个静态录像。在整个检测过程中，试剂I(R1)、样本(三)、试剂2(R2)加入以及搅拌的时间点都是固定的。我们知道了反应曲线是怎么来的之后，需要知道什么样的曲线算正常。一般正常的反应曲线：a.比较平滑，无明显的跳点；b

5、.加入R2前后吸光度会发生明显的变化(低浓度样本除外)；c.终点法的反应曲线，会有一段曲线的吸光度基本无变化；d.速率法的反应曲线，基本成一条直线(两点速率法除外)。生化的反应曲线可以分为终点法和速率法两大类，以下列举了一些正常的反应曲线供参考：1.终点法的反应曲线：反应到达终点后反应混合物的吸光度不再变化(RI主要用于消除干扰，R2加入之后，反应启动)，就像你炒好的菜在一段时间内味道是不变的。如下图：Routine司包Oata Dnw Scak ChangeRW2.速率法的反应曲线：随着反应的进行，吸光度越来越大，但速率保持不变，R2之后基本成一条直线，无明显跳点（两点速率法除外），如下图:

6、RoutineData MonitorLMDhtAw Remove(1)结果出现负值(终点法项目)：a.反应曲线有可能是一条直线，样本或R2有可能没有加入；b.R2加入之前的吸光度比加入后还高，试剂1和试剂2位置放反或者严重脂血标本。(2)结果明显偏低(速率法项目)：反应曲线可能变成了类似于终点法的曲线，也就是我们通常说的底物耗尽，需要稀释重测。(3)试剂过期或污染、搅拌棒破损、携带污染以及冲洗站滴水也会在反应曲线上有所体现。(4)总之，在结果比较可疑的情况下，可以调出反应曲线看看是否正常，有助于找出问题所在。注意事项：1 .不同厂家或型号的仪器，加入样本和试剂的顺序可能不同。2 .部分仪器横

7、坐标是直接用时间表示，比如贝克曼LX/Dxc系列用的是秒，另外LX/Dxc系列的加样顺序有可能是R1+S+R2或者R1R2+So3 .部分仪器没有把各个点连接起来，看到是由点组成的曲线。4 .看反应曲线时，注意纵坐标的刻度，。5 .反应曲线界面还可以看到很多的信息，比如光电校正、试剂空白、定标的时间以及每一点吸光度，这些都会有助于判断结果异常的原因。常见正常反应曲线简易图终点法速率法常见异常反应曲线1.比色杯异常：JIVW/OOO2,搅拌棒问题3.冲洗站问题4.底物耗尽避免底物耗尽带来误差一方面，在审核报告时，要综合考虑整张报告单各个项目的结果,对有疑问或者矛盾的项目结果，要查看反应曲线，并及

8、时与临床医生沟通，结合病人的情况评估检测报告是否存在偏差。另一方面，可以借助生化仪上面自带的参数设置，设置好底物耗尽的相关参数，让仪器自动报警。底物耗尽的参数大概分两种：1 .线性度：一般厂家设定的线性度为15%,其含义就是所有检测点的OD值与理想拟合曲线的线性相关度要在15%之内，超出这个范围就是超限，仪器对此结果就会报警。以图2为例，反应阶段读取的曲线是b-c-d,而最后计算的曲线是b-d,明显可以看出C点远离了b-d直线，c点附近读取的吸光度都偏离大于15%,仪器会报警。个人意见，15%的线性度有些大，最好设置在10%以内，以保证结果的准确性。2 .吸光度限值或者反应界限：也就是单位时间内吸光度的变化（上升或下降）不能超过多少，或者初始反应的曲线斜率不能超过多少，以保证在读取反应阶段的吸光度结束前，底物都还是充足的。但由于这个参数的设置跟底物的量，反应阶段开始和结束的时间设定等都有关系，。