哈维氏弧菌PCR检测试剂盒说明书.docx

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1、哈维氏弧菌PCR检测试剂盒说明书哈维氏弧菌PCR检测试剂盒说明书产品特征：灵敏度高：能对低拷贝或多样性模板进行定量。特异性强：采用热启动酶的激活机制，抑制非特异性扩增。重复性好：扩增曲线重合度高，受干扰影响少扩增效率高：扩增曲线Ct值低，起峰快，效率高。原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。哈维氏弧菌PCR检测试剂盒需要自备的器材：1 .仪器：分析天平、离心机、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、20冰箱、可调移液器（2L、20L、200L、1000L）。2 .耗材：荧光PCR反应管、

2、眼科剪、眼科镶、生理盐水、1.5mL经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、吸头（10L、200L.1000L）、灭菌双蒸水。具有下列特点：1.产品仅用于科研即开即用，用户只需要提供样品DNA模板，操作简单，定量准确快速。3 .引物经过优化，特异性强。预期的PCR产物长度为560bpo4 .PCRmix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。5 .提供阳性对照，便于分析试验结果。检测方法：1. I法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的

3、增加wan全同步。定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图2. TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，产品仅用于科研使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成Wan全同步。哈维氏弧菌PCR检测试剂盒荧光定量PCR实验步骤：取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其Wan全溶解。两相分离每Iml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的Ivfang,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30。C孵

4、育2到3分钟。4。C下1200OrPnI离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚Ivfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZoL试剂的60%oRNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30。C蜉育10分钟后，于4。C下1200OrPm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗移去上清液，每ImlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少Iml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH20配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4。C下7000

5、rpm离心5分钟。RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥510分钟。溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40UI用枪反复吹打几次，使其Wan全溶解，获得的RNA溶液保存于80。C待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和28Onnl处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。反应五要素：斯氏分枝杆菌PCR检测试剂盒费用参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度

6、。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核昔酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度：1530bp,常用为20bp左右。引物扩增跨度：以200500bp为宜，特定条件下可扩增长至IOkb的片段。引物碱基：G+C含量以4060%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的喋吟或咯哽核甘酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对

7、而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度O.Iumol或10100pmol,以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。哈维氏弧菌PCR检测试剂盒实验注意事项：1）RTPCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料，不同的样本有不同要求，实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况；2）客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和ID号；3）客户尽量不要提供DNA或RNA样品。4

8、）样本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。实时荧光定量PCR（quantitativerealtimePCR,qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，*通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA.RNA样品进行定量（包括*定量和相对定量）和定性分析。主要服务:DNA或RNA的*定量分析、基因表达差异分析、基因分型。主要技术:引物设计、RNA提取、CDNA合成、qPCRo