项目说明及技术部分评分参数.docx

上传人:王** 文档编号:100014 上传时间:2022-12-21 格式:DOCX 页数:5 大小:28.58KB
下载 相关 举报
项目说明及技术部分评分参数.docx_第1页
第1页 / 共5页
项目说明及技术部分评分参数.docx_第2页
第2页 / 共5页
项目说明及技术部分评分参数.docx_第3页
第3页 / 共5页
项目说明及技术部分评分参数.docx_第4页
第4页 / 共5页
项目说明及技术部分评分参数.docx_第5页
第5页 / 共5页
亲,该文档总共5页,全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述

《项目说明及技术部分评分参数.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《项目说明及技术部分评分参数.docx(5页珍藏版)》请在优知文库上搜索。

1、项目说明及技术部分评分参数一、采购标的名称:结核菌靶基因测序服务预算金额(万元):22.6项目联系人:北京胸科医院病理科车佳璐二、采购需求结核杆菌靶基因突变位点检测(本实验为灭活菌株,不具有传染性)三、技术要求1、采购内容明细样本类型:痰样本DNA样本数量:226个每项样本检测服务内容的控制价:IOOO元(不满足为废标项)2、检测标准及指标要求引物设计将靶基因全部覆盖,对应amplicon的测序深度均一,覆盖深度大于IOo0,有效数据占比大于90%o下机后提供位点信息及原始数据。四、商务要求#1、服务期限:60个工作日内完成测序和数据反馈及剩余样本返回。2、服务地点:公司3、付款条件(进度和方

2、式):凭公司提供的结题报告、发票在两周内以银行转账方式支付。五、服务要求#1、技术服务人员的相关要求(如适用):精通测序原理,可以解答相关实验细节问题,对于数据分析可以提供必要的指导。2、拟投入实验仪器及设备(如需)要求:IifC平台(不满足为废标项)3、其他服务要求# 1.具有C1.IA和室间质评一类资质# 2.提供以往同类实验服务(靶基因测序)报告或报告样板包括覆盖率#、平均测序深度#、测序深度均一性#提供位点信息#(突变位点#,相应测序深度#,突变频率#,每个amplicon的测序深度#)# 3.样本检测报告反馈时间小于7天4.后续服务免费(不满足为废标项)*5.按时返回剩余样本#6.提

3、供每个样本的质控信息测序服务要求测序平台:Iife平台具体服务内容:针对临床样本检测结核菌靶基因的引物设计及二代测序实验。要求:引物设计将靶基因全部覆盖,对应amplicon的测序深度均一,覆盖深度大于1000,有效数据占比大于90%o1 .文库构建:将PCR酶混合液、DNA扩增引物混合液和DNA样本取出,置于冰上待融化后,涡旋振荡混匀离心,置于冰上备用。表IoDNA目标区域扩增反应条件阶段温度时间循环数酶的激活992分钟1变性9915秒25退火和延伸604分钟保持IOoC最多1小时一2 .引物的消化将消化酶取出,轻弹混匀(避免振荡),瞬时离心,置于冰上备用;将PCR扩增产物从PCR仪中取出,

4、瞬时离心后,在每管扩增产物中加入2U1.的消化酶,用移液器吹打混盖紧PCR管盖,瞬时离心,以收集管壁和管盖上的残余反应液,将PCR管置于冰上备用。表11引物消化反应条件温度时间5010分钟5510分钟6020分钟10保持(最多1小时)3 .扩增子的接头连接将Pl接头,1-48种待用的特异性接头,DNA连接酶缓冲液取出,室温融化后,涡旋振荡混匀离心,置于冰盒上备用;取出DNA连接酶轻弹混匀离心,置于冰盒上备用;将文库纯化磁珠充分涡旋混匀离心后置于室温至少30分钟表12一个反应所需接头混合液的配制组分体积Pl接头0.51.特异性接头0.51.无核酸酶水l1.总体积21.将配制好的接头混合液涡旋振荡

5、混匀后,瞬时离心,置于冰上备用。连接体系的配制从PCR仪中取出含引物消化产物的PCR管,按照表13要求向其中依次加入DNA连接酶缓冲液、接头混合液、DNA连接酶用移液器吹打混匀后,盖紧PCR管盖,瞬时离心,以收集管壁和管盖上的残余反应液,将PCR管置于冰上备用连接反应将PCR管置于PCR仪上,按照表14设置程序,进行连接反应:表14扩增子接头连接反应条件温度时间2230分钟7210分钟10保持(最多1小时)3文库纯化磁珠纯化文库1)PCR反应结束将八联排放置在小黄板上,向各管中分别加入45UI的文库纯化磁珠(1.5*体积),涡混使磁珠和DNA充分混匀,盖好八连管盖。2)室温静置5InirI,使

6、磁珠和DNA充分孵育结合。3)将八联排简短离心后置于96孔磁力架上5min,至溶液澄清,弃废液,注意枪头不要碰到磁珠。4)加入190UI新鲜配制的70%乙醇,稍静置,翻转八联排2次,移液器调至200UI小心地吸除PCR管中的上清,注意枪头不要碰到磁珠。5)重复步骤4)一次。6)用IOUI的移液器吸除残余的乙醇,开盖2-4min使乙醇完全挥发,干燥程度以没有反光表面略粗糙最好。注:乙醇残留会抑制后面的文库扩增。7)将八联排从磁力架上取下,向PCR管中加入30UI文库洗脱液,涡旋振荡混匀,简短离心以收集管壁和管盖上的残余溶液。8)将八联排简短离心后置于磁力架上2min至溶液澄清,用移液器小心地转移

7、25ul上清至新的EP管中,即纯化的文库,在EP管上标记文库编号。4测定文库浓度使用Qubit测定每个文库的浓度,并计算其总量。1)向0.5UI离心管中加入198UIdsDNAHSBuffero2)力UIUIdsDNAHSReagent染料混匀。3)力UlUI样本震荡混匀,简短离心后避光静置2分钟测其QUbit。5文库qPCR定量1)文库定量标准品的梯度稀释a.将文库定量标准品置于冰上彻底融化,充分振荡混匀,简短离心后置于冰上备用;b.用无核酸酶水将标准品(68pM)按下表进行10倍梯度稀释,涡旋IOS后简短离心,重复3次,置于冰上备用。标准品文库标准品无核酸酶水稀释倍数终浓度Sl51.(未稀

8、释)451.106.8pMS251.Sl451.IOO0.68pMS351.S2451.10000.068pMS45H1.S3451.100000.0068pM2)AnIPIiSeq文库的梯度稀释将文库按1:20进行稀释,再按1:50进行稀释,建议冰上操作:名称文库Nuclease-freeWater总稀释倍数Sample1-12U1.文库381.1:20Sample1-221.Sample1-1981.1:10003)PCR反应体系的制备将文库定量探针反应液涡旋振荡后离心备用,文库定量混合液轻柔颠倒混匀离心备用(MasterMix不能vortex)。4)反应体系配制a.每个样品做2个平行实验

9、。b.实验的反应体系101.,根据反应总数配制MaSterMiX和ASSay混合的总体系:试剂单个样本文库定量反应体系总量文库定量混合液51.2*(文库总个数十标准品个数4)+损耗5*5文库定量探针反应液0.51.2*(文库总个数+标准品个数4)+损耗5*0.5c.将配制好的文库定量反应体系轻柔颠倒混匀后,分装8联管中,每孔分配5.5ul.d.分别取4.51.I1.稀释的标准品(SI,S2,S3和S4)和稀释适当倍数的文库加入至相应的qPCR管中,盖紧PCR管盖,短暂离心后涡旋振荡混匀再离心,放入qPCR仪中。e.Real-timePCR仪的设置:1)依次设置标准品的浓度。2)设置RoX作为参

10、考染料,选择FAMBI染料/MGB作为TaqMarl探针的报告/淬灭剂。3)反应体系IOIl1.。4)选择“Standard”作为运行模式。5)设置反应条件(其他型号仪器查询官网)。阶段温度时间循环数UDG孵育50oC2min酶的激活95oCImin变性95oC15s40退火和延伸60oC45s5)数据的处理根据QPCR结果,计算出未稀释的文库浓度(QPCR浓度乘以相应的稀释倍数)。6)文库质控标准文库QPCR浓度20pM,即此文库合格7)文库的稀释及混样(按照POOIing信息表进行POOIing)混样总体积1001.,浓度6pMo要求:实验完成后提供每一步样本质控信息。数据分析要求:下机后公司负责原始数据处理分析,提供数据质控:覆盖率、平均测序深度、测序深度均一性,提供位点信息(突变位点,相应测序深度,突变频率,每个amplicon的测序深度)及原始数据。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 建筑/环境 > 桩基础

copyright@ 2008-2023 yzwku网站版权所有

经营许可证编号:宁ICP备2022001189号-2

本站为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。装配图网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知装配图网,我们立即给予删除!